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技術原理

什么是數字PCR?數字PCR的優勢!

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2021-11-19

    新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)大流行導致了公共衛生危機和全球恐慌,到目前為止確診人次已經超過二億二千萬例。Delta、Lambda新冠變異病毒已經出現在全球90多個國家。如何快速準確診斷病毒特別是變異株,對治療和防疫工作具有重要意義。逆轉錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)是國內應用最廣泛的新冠檢測技術。在疫情防控工作中,不同的核酸檢測技術也得到了快速的發展,包括數字PCR(dPCR),逆轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP)和轉錄介導擴增(TMA)等。dPCR是一種新興的核酸擴增技術,允許絕對定量核酸。它具有靈敏度高、精度高、抗干擾能力強等優點。

    什么是數字PCR

    數字PCR技術也稱為第三代PCR技術,是一種核酸高靈敏檢測和絕對定量的新方法。同傳統的PCR相比,數字PCR增加了對反應體系進行分隔(Partition)的操作,將幾十微升的反應體系分隔成了數萬微小獨立反應體系,核酸模板在這種分隔過程中被充分稀釋,理想狀態下每個微滴中含有1個分子的核酸模板,擴增完成后對所有的液滴進行熒光信號識別并計數,計算出陰性和陽性反應的數量,通過泊松分布原理計算靶標分子的濃度。從而實現靶標分子的絕對定量。數字PCR不依賴標準曲線定量,并且不受PCR擴增效率影響,具有更高靈敏度和準確度。
    數字PCR的原理示意圖

    數字PCR的由來

    20世紀末,Bert Vogelstein等人在美國科學院院刊PNAS上首次提出了數字PCR(Digital PCR, dPCR)的概念,并表明該技術可用于研究罕見的癌癥突變。

    Bert Vogelstein

    2003年,Kinzler和Vogelstein繼續完善dPCR,并創建了一種改進的方法,他們將其稱為BEAMing技術,即“珠子,乳狀液,擴增和磁性”的首字母縮寫。BEAMing技術使用乳狀液在單個試管中分隔擴增反應。這一變化能在一次運行中將該PCR擴展到成千上萬的反應。

    隨著納米制造技術和微流體技術(nanofabrication and microfluidics)的發展,數字PCR技術遇到了突破瓶頸的最佳契機。

    2006年,Fluidigm公司推出了第一臺商業化的基于芯片的商品化數字PCR系統,Fluidigm的IFC平臺使用物理矩陣的策略,他們的qdPCR 37K系統“集成電路”利用該公司的微流控專長,可將48個樣品逐個分布在770個微反應單元中。

    2013年,Life technologies推出了QuantStudio3D數字PCR系統。采用高密度的納升流控芯片技術,樣本均勻分配至20000個單獨的反應孔中。在整個工作流程中,樣本之間保持完全隔離,可以有效防止樣品交叉污染,減少移液過程,簡化操作步驟。同時芯片式設計避免了微滴式系統可面臨的管路堵塞問題。

    目前,dPCR的基本方法都已經建立,根據反應單元的不同形式,主要可分為微板式、微腔式和微滴式三大類系統。目前,市場上主要的數字PCR產品主要是基于微滴式和芯片式,如Bio-Rad公司的QX200微滴式系統和Thermo Fisher公司的Quant Studio系統等。
    數字PCR分類及特點

    數字PCR的優勢

    數字PCR是生命科學領域最引人矚目的創新之一。與其他傳統分子診斷技術相比,數字PCR技術的優勢在于:

    高靈敏度,可實現單分子級檢測
    單分子級檢測

    dPCR本質上將一個傳統的PCR反應變成了數萬個PCR反應, 在這數萬個反應單元中分別獨立檢測目的序列,從而大大提高了檢測的靈敏度。

    高精度,可檢測微小差異

    在大量野生型基因存在的情況下精準地檢測低含量的突變基因是目前的研究難點之一,競爭性反應嚴重影響突變基因的檢測。dPCR技術從背景序列中檢測低豐度目的序列的能力和高靈敏度的特點使得這一技術特別適合在復雜背景中檢測稀有突變。

    絕對定量,不依賴標準品和參考曲線

    數字PCR直接計算目的序列的拷貝數,無需依賴于Ct值和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測。

    高重復性,消除擴增效率偏差影響

    FAM、HEX和Cy5通道濃度平均值和CV值的數據表明, 在所述的實驗條件下,三種測試濃度之間沒有統計學差 異(p<0.05)。

    強耐受抑制物,適用于多種復雜樣本

    血液、糞便、食品、土壤等樣本中含有大量PCR反應的抑制物,極大地影響 了PCR反應效率。另外,在某些檢測中,難以制備測定標準曲線所需的標準物質。dPCR不受PCR抑制物的影響、不依賴標準曲線的優勢,使其特別適合于這些復雜樣本中基因表達的準確定量檢測。

    應用領域

    科學界對于數據準確性和結果可靠性的要求越來越高,更多的實驗室將目光轉向擁有絕對定量方式、高靈敏度和高重復性特質的數字PCR技術。dPCR作為一種新興的靶核酸絕對定量技術,對低豐度DNA具有高度的敏感性和特異性,對擴增抑制劑具有高度的抗性。因此,dPCR可用于低拷貝病毒的檢測、病毒載量的測定、標準物質的制備、環境中病毒濃度的監測、病毒變異的檢測和SARS-CoV-2藥物的評價。

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