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技術原理

蛋白質的分離與純化

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2021-11-10

一,蛋白質的提取

大部分蛋白質都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液,少數與脂類結合的蛋白質則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中,因些,可采用不同溶劑提取分離和純化

蛋白質及酶。

(一)水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑,通常用量是原材料體積的1-5倍,提取時需要均勻的攪拌,以利于蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面,多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大,因此,溫度高利于溶解,縮短提取時間。但另一方面,溫度升高會使蛋白質變性失活,因此,基于這一點考慮提取蛋白質和酶時一般采用低溫(5度以下)操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制劑(如二異丙基氟磷酸,碘乙酸等)。

下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。

1、pH值

蛋白質,酶是具有等電點的兩性電解質,提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH 范圍內。用稀酸或稀堿提取時,應防止過酸或過堿而引起蛋白質可解離基團發生變化,從而導致蛋白質構象的不可逆變化,一般來說,堿性蛋白質用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白質用偏堿性的提取液。

2、鹽濃度

稀濃度可促進蛋白質的溶,稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合,具有保護蛋白質不易變性的優點,因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽,一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

(二)有機溶劑提取法

一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶,不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑,它們具的一定的親水性,還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越,一是因為丁醇親脂性強,特別是溶解磷脂的能力強;二是丁醇兼具親水性,在溶解度范圍內(度為10%,40度為6.6%)不會引起酶的變性失活。另外,丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣,也適用于動植物及微生物材料。

二、蛋白質的分離純化

蛋白質的分離純化方法很多,主要有:

(一)根據蛋白質溶解度不同的分離方法

1、蛋白質的鹽析

中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質的溶解度增加,此稱鹽溶;當鹽濃度繼續升高時,蛋白質的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質溶液中,高濃度的鹽離子(如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力,可奪取蛋白質分子的水化層,使之“失水”,于是蛋白質膠粒凝結并沉淀出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由于各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉淀。 

影響鹽析的因素有:

(1)溫度:除對溫度敏感的蛋白質在低溫(4度)操作外,一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時溶解度低,更容易鹽析。

(2)pH值:大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。

(3)蛋白質濃度:蛋白質濃度高時,欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉淀出來(共沉現象)。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質含量在2.5-3.0%。

蛋白質鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨,它的優點是溫度系數小而溶解度大(25度時飽和溶液為4.1M,即767克升;0度時飽和溶解度為3.9M,即676克/升),在這一溶解度范圍內,許多蛋白質和酶都可以鹽析出來;另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間,當用其他pH值進行鹽析時,需用硫酸或氨水調節。蛋白質在用鹽析沉淀分離后,需要將蛋白質中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質溶液裝入秀析袋內(常用的是玻璃紙),用緩沖液進行透析,并不斷的更換緩沖液,因透析所需時間較長,所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽,所用的時間就比較短。

2、等電點沉淀法

蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質的等電點有差別,可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉淀,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結合用。

3、低溫有機溶劑沉淀法

用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數蛋白質溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質較易變性,應在低溫下進行。

(二)根據蛋白質分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾

透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質分子通過半透膜,而蛋白質留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。

2、凝膠過濾法

也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadexged)和瓊脂糖凝膠(agarose gel)。

(三)根據蛋白質帶電性質進行分離

蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同,可將其分開。

1、電泳法

各種蛋白質在同一pH條件下,因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質作為載體,電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度,當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時,到達各自等電點的pH位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質。

2、離子交換層析法 

離子交換劑有陽離子交換劑(如:羧甲基纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素;DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素),當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時,帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上,隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。(詳見層析技術章)

(四)根據配體特異性的分離方法-親和色譜法

親和層析法(aflinity chromatography)是分離蛋白質的一種極為有效的方法,它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來,而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand)的分子能特異而非共價地結合。其基本原理:蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在,每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質,因此蛋白質的分離(Separation),提純(Purification)和鑒定(Characterization)是生物化學中的重要的一部分,至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來,因此往往采取幾種方法聯合使用。

細胞的破碎

1、高速組織搗碎:將材料配成稀糊狀液,放置于筒內約1/3體積,蓋緊筒蓋,將調速器先撥至最慢處,開動開關后,逐步加速至所需速度。此法適用于動物內臟組織、植物肉質種子等。

2、玻璃勻漿器勻漿:先將剪碎的組織置于管中,再套入研桿來回研磨,上下移動,即可將細胞研碎,此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高,適用于量少和動物臟器組織。

3、超聲波處理法:用一定功率的超聲波處理細胞懸液,使細胞急劇震蕩破裂,此法多適用于微生物材料,用大腸桿菌制備各種酶,常選用50-100毫克菌體/毫升濃度,在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘,此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱,應采取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。

4、反復凍融法:將細胞在-20度以下冰凍,室溫融解,反復幾次,由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹,使細胞結構破碎。

5、化學處理法:有些動物細胞,例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉(SDS)、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞,細菌細胞壁較厚,可采用溶菌酶處理效果更好。

無論用哪一種方法破碎組織細胞,都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中,使大分子生物降解,導致天然物質量的減少,加入二異丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或減慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,還可通過選擇pH、溫度或離子強度等,使這些條件都要適合于目的物質的提取。濃縮、干燥及保存

一、樣品的濃縮

生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品變得很稀,為了保存和鑒定的目的,往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的:

1、減壓加溫蒸發濃縮

通過降低液面壓力使液體沸點降低,減壓的真空度愈高,液體沸點降得愈低,蒸發愈快,此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。 

2、空氣流動蒸發濃縮

空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液,表面不斷通過空氣流;或將生物大分子溶液裝入透析袋內置于冷室,用電扇對準吹風,使透過膜外的溶劑不沁蒸發,而達到濃縮目的,此法濃縮速度慢,不適于大量溶 液的濃縮。

3、冰凍法

生物大分子在低溫結成冰,鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中,操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體,然后緩慢地融解,利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時,不含蛋白質和酶的純冰結晶浮于液面,蛋白質和酶則集中于下層溶液中,移去上層冰塊,可得蛋白質和酶的濃縮液。

4、吸收法

通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應,對生物大分子不吸附,易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇,聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等,使用聚乙二醇吸收劑時,先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里,外加聚乙二醇復蓋置于4度下,袋內溶劑滲出即被聚

乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達到所需要的體積。

5、超濾法

超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法,不液體在一定壓力下(氮氣壓或真空泵壓)通過膜時,溶劑和小分子透過,大分子受阻保留,這是近年來發展起來的新方法,最適于生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽,并具有成本低,操作方便,條件溫和,能較好地保持生物大分子的活性,回收率高等優點。應用超濾法關鍵在于膜的選擇,不同類型和規格的膜,水的流速,分子量截止值(即大體上能被膜保留分子最小分子量值)等參數均不同,必須根據工作需要來選用。另外,超濾裝置形式,溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo 超濾膜的分子量截留值:用上面的超濾膜制成空心的纖維管,將很多根這樣的管攏成一束,管的兩端與低離子強度的緩沖液相連,使緩沖液不斷地在管中流動。然后將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖液流過纖維管時,則小分子很易透過膜而擴散,大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法,由于透析面積增大,因而使透析時間縮短10倍。

二、干燥

生物大分子制備得到產品,為防止變質,易于保存,常需要干燥處理,最常用的方法是冷凍干燥和真空干燥。真空干燥適用于不耐高溫,易于氧化物質的干燥和保存,整個裝置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外,同時增加了溫度因素。在相同壓力下,水蒸汽壓隨溫度下降而下降,故在低溫低壓下,冰很易升華為氣體。操作時一般先將待干燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體,然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干后的產品具有疏松、溶解度好、保持天然結構等優點,適用于各類生物大分子的干燥保存。

三、貯存

生物大分子的穩定性與保存方法的很大關系。干燥的制品一般比較穩定,在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化,貯藏要求簡單,只要將干燥的樣品置于干燥器內(內裝有干燥劑)密封,保持0-4度冰箱即可,液態貯藏時應注意以下幾點。

1、樣品不能太稀,必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏,樣品太稀易使生物大分子變性。

2、一般需加入防腐劑和穩定劑,常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等,如酶也可加入底物和 輔酶以提高其穩定性。此外,鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標準緩沖液中。

3、貯藏溫度要求低,大多數在0度左右冰箱保存,有的則要求更低,應視不同物質而定??梢罁鞍踪|不同性質與之相對應的方法將蛋白質混合物分離:

1.分子大小

不同種類的蛋白質在分子大小方面有一定的差別,可用一些簡便的方法,使蛋白質混合物得到初步分離。

1.1透析和超濾

透析在純化中極為常用,可除去鹽類(脫鹽及置換緩沖液)、有機溶劑、低分子量的抑制劑等。透析膜的截留分子量為5000左右,如分子量小于10000的酶液就有泄露的危險,在純化中極為常用,可除去鹽類、有機溶劑、低分子量的抑制劑等。超濾一般用于濃縮和脫色

1.2離心分離置換緩沖液

許多酶富集于某一細胞器內,勻漿后離心得得到某一亞細胞成分,使酶富集10~20倍,再對特定的酶進行純化。差速離心,分辨率較低,僅適用于粗提或濃縮。速率區帶法,如離心時間太長所有的物質都會沉淀下來,故需選擇最佳分離時間,可得到相當純的亞細胞成分用于進一步純化,避免了差速離心中大小組分一起沉淀的問題,但容量較小,只能用于少量制備。等密度梯度離心常用的離主介質有蔗糖、聚蔗糖、氯化銫、溴化鉀、碘化鈉等等

1.3凝膠過濾

這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一,注意使要離的蛋白質分子量落在凝膠的工作范圍內。選擇不同的分子量凝膠可用于脫鹽、置換緩沖液及利用分子量的差異除去熱源。

2.形狀

蛋白質在離心通過溶液運動時,或通過膜、凝膠過濾填料顆?;螂娪灸z中的小孔運動時,都會受到形狀的影響:對兩種相同質量的蛋白質而言,球狀蛋白質具有較小的有效半徑(斯托克半徑),通過溶液沉降時遇到的摩擦力小,沉降較快而顯得比其它形狀的蛋白質大;反之,在體積排阻色譜時,斯托克半徑較小的球狀蛋白質更容易擴散進入凝膠過濾填料顆粒內部,較遲洗脫出來,因而顯得比其它形狀的蛋白質要小。

3.溶解度

利用蛋白質的溶解度的差別來分別各種蛋白質常用的方法。影響蛋白質溶解度的外界因素很多,其中主要有:溶液的pH、離子強度、介電常數和溫度,但在同一的特定外界條件下,不同的蛋白質具有不同的溶解度。適當改變外界條件,控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度

3.1pH控制和等電點沉淀

蛋白質在其等電點一般較不易溶解。

3.2蛋白質的鹽溶和鹽析

3.3有機溶劑分級法

蛋白質在不同的溶劑中的溶解度有很大不同,從基本不溶(<10μg/ml)直至極易溶解(>300mg/ml)不等。影響蛋白質溶解度的可變因素包括溫度、pH、

溶劑的極性、離子性質和離子強度。引起蛋白質沉淀的有機溶劑的濃度不同,故控制有機溶劑的濃度可分離蛋白質。 水溶性非離子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白質的沉淀。

3.4溫度

不同的蛋白質在不同的溫度具有不同的溶解度和活性。大多數蛋白質在低溫下比較穩定,故分離操作一般在0℃或更低溫度下進行。

4.電荷

蛋白質凈電荷取決于氨基酸殘基所帶的正負電荷的總和,如中性溶液中帶凈負電荷則稱為酸性蛋白質,

4.1電泳

不僅是分離蛋白質混合物和鑒定蛋白質純度的重要手段,而且也是研究蛋白質性質很有用的方法。等電聚焦分辨率很高,pI有0.02pH的差異就能分開。2D-PAGE分離蛋白質分辨率已經發展到100000個蛋白點。

4.2離子交換層析

改變蛋白質混合物溶液中的鹽離子強度、pH和(陰、陽)離子交換填料,不同蛋白質對不同的離子交換填料的吸附容量不同,蛋白質因吸附容量不同或不被吸附而分離。

洗脫可采用保持洗脫劑成分一直不變,也可采用改變洗脫劑的鹽度或pH的方法洗脫,后一種可分分段洗脫和梯度洗脫。梯度洗脫一般效果好,分辨率高,特別是使用交換容量小,對鹽濃度敏感的離子交換劑,多用梯度洗脫??刂葡疵搫┑捏w積(與柱床體體積相比)、鹽濃度和pH,樣品組分能從離子交換柱上分別洗脫下來。

蛋白分子暴露在外表面的側鏈基團的種類和數量不同,故在一定的PH值和離子強度的緩沖液的所帶的電荷不同

5.電荷分布

電荷的氨基酸殘基可均勻地分布于蛋白質的表面,既可以適當的強度與陽離子交換柱結合也能以適當強度與陰離子結合,因多數蛋白質都有不能在單一的溶劑條件下同時與兩種類型的離子交換柱結合,故可得用此性質純化;電荷的氨基酸殘基亦可成簇分布,使某一區域帶強正電荷而另一區域帶強負電荷,呈強酸性或強堿性,只能在極端pH與陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂結合,如鈣調蛋白只能在pH2時與陽離子交換樹脂結合。

6.疏水性

多數疏水性的氨基酸殘基藏在蛋白質的內部,但也有一些在表面。蛋白質表面的疏水性氨基酸殘基的數目和空間分布決定了該蛋白質是否具有與疏水柱填

料結合從而利用它來進行分離的能力。

因其廉價和純化后的蛋白質具有生物活性,是一種通用性的分離和純化蛋白質的工具。高濃度鹽水溶液中蛋白質在柱上保留,在低鹽或水溶液中蛋白質從柱上被洗脫,故特別適用于濃硫酸銨溶液沉淀分離后的母液以及該沉淀用鹽溶解后的含有目標產品的溶液直接進樣到柱上,當然也適用7mol/鹽酸胍或8mol/L脲的大腸桿菌的治療蛋白質提取液直接進樣到柱上,在分離的同時也進行了復性。

7.密度

多數蛋白質的密度在1.3~1.4g/cm3之間,分級分離蛋白質時一般不常用此性質,不過對含有大量磷酸鹽或脂質的蛋白質與一般蛋白質在密度上明顯不同,可用密度梯度法離心與大部分蛋白質分離。

8.基因工程構建的純化標記 

通過改變 cDNA在被表達的蛋白的氨基端或羧基端加入少許幾個額外氨基酸,這個加入的標記可用來作為一個有效的純化依據。

8.1GST融合載體

使要表達的蛋白質和谷胱甘肽S轉移酶一起表達,然后利用GlutathioneSepharose 4B作親和純化,再利用凝血酶或因子Xa切開。

8.2蛋白A融合載體

使要表達的蛋白和蛋白A的IgG結合部位融合在一起表達,以IgGSepharose純化。

8.3含組氨酸標記(Histidine-tagged)Chelating Sepharose

最通行的標記之一,是在蛋白質的氨基端加上6~10個組氨酸,在一般或變性條件(如8M尿素)下借助它能與Ni2+螯合柱緊緊結合的能力,用咪唑洗脫,或將pH降至5.9使組氨酸充分質子化,不再與結合Ni2+使之得以純化。重組蛋白在設計、構建時已融入純化構想。樣品多夾雜了破碎細胞或可溶產物,擴張床吸附技術STREAMLINE適合做粗分離。

9.親和能力

結合效率高,分離速度快的特點。配基可是酶的底物、抑制劑、輔因子、特異性的抗體、吸附后可改變緩沖液的離子強度和PH的方法,洗耳恭聽脫下來,也可用更高濃度的同一配體溶液或親和力更強的配體溶液洗脫親和層析固定相的配基與生物分子之間的特殊的生物大分子親和能力不同來進行相互分離的,依親和選擇性的高低分為:基團性親和層析,固定相上的配基對一類基團的極強的親和力。如含有糖基的一類蛋白質或糖蛋白對三嗪染料顯示特別強的吸附能力;高選擇性(專一性)親和層析,配基僅對某一種蛋白質有特別強的親和性。如單克隆抗體對抗原的特異性的吸附。親和層析除特異性的吸附外,仍然會因分子的錯誤認別和分子間非選擇性的作用力而吸附一些雜蛋白質,另洗脫過程中的配體不可避免的脫落進入分離體系。

與超濾結合起來,將兩者優點集中形成超濾親和純化,具有高分離效率和大規模工業化的優點,適用于初分離。按配基的不同可分為:

(1)金屬螯合介質

過渡金屬離子Cu2+、Zn2+和Ni 2+等以亞胺絡合物的形式鍵合到因定相上,由于這些金屬離子與色氨酸、組氨酸和半胱氨酸之間形成了配價鍵,從而形成了亞胺金屬—蛋白螯合物,使含有這些氨基酸的蛋白被這種金屬螯合親和色譜的固定相吸附。螯合物的穩定性受單個組氨酸和半胱氨酸解離常數所控制,從而亦受流動相的pH和溫度的影響,控制條件可以使不同蛋白質相互分離。

(2)小配體親和介質

配體有精氨酸、苯甲酰胺、鈣調因子、明膠、肝素和賴氨酸等等。

(3)抗體親和介質

即免疫親和層析,配體有重組蛋白A和重組蛋白G,但蛋白A比蛋白G專一,蛋白G能結合更多不同源的IgG。

(4)顏料親和介質

染料層析的效果除主要取決于染料配基與酶的親和力大小外,還與洗脫緩沖液的種類、離子強度、PH值及待分離的樣品的純度有關。配體有CibacronBlue 和ProcionRed兩種。在一定的條件下,固定化的染料能起陽離子交換劑的作用,為了避免此現象的發生,最好要離子強度小于0。1和PH大于7時操作。

(5)外源凝集素親和介質

配體有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麥芽外源凝集素,固相外源凝集素能和數種糖類殘基發生可逆反應,適合純化多糖、糖蛋白。

10.非極性基團之間作用力

溶質分子中的非極性基團與非極性固定相間的相互作用力(非選擇性分散力或倫敦力)大小與溶質分子極性基團與流動力相中極性分子在相反方向上相互作用力的差異進行分離。因其流動相中的置換劑是極性小于水的有機溶劑(如甲醇、乙腈、四氫呋喃等),這些有機溶劑可能使許多蛋白質分子產生不可逆的變性;流動相中須有離子對試劑(如三氟乙酸、甲酸、磷酸等)存在才可使分離有效地進行和獲得高的質量回收率;分離須在酸性介質中進行(一般pH在2~3之間),又有一些蛋白質會在后兩種條件下產生不可逆的分子構象變化,故在生物大分子中人分離純化中受到限制,但分子構象變化可逆的蛋白質而言是有效的方法。正相色譜在生物大分子中的分離和純化中應用相對較少,因所用的溶劑很貴。

11.可逆性締合

在某些溶液條件下,有一些酶能聚合成二聚體、四聚體等,而在另一種條件下則形成單體,如相繼在這兩種不同的條件下按大小就可以進行分級分離。

12.穩定性

12.1熱穩定性

大多數蛋白質加熱到95℃時會解折疊或沉淀,利用這一性質,可容易地將一種經這樣加熱后仍保持其可溶性活性的蛋白質從大部分其它細胞蛋白質中分離開。

12.2蛋白酶解穩定性

用蛋白酶處理上清液,消化雜蛋白,留下抗蛋白酶解抗性蛋白質。

13.分配系數

即利用雙水相萃取分離,常用的生物物質分離體系有:聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(DEXTRAN)、PEG/磷酸鹽、PEG/硫酸銨等。由于具有含水比例高、選用的聚合物及鹽對酶無毒性、分離設備與化學工業通用等優點,在工業上目益受重視。分配行為受聚合物分子大小、成相濃度、PH、無機鹽種類等因素影響,

發展:具有親和雙水相萃取及膜分離雙水相萃取等新型雙水相分離技術。雙向水溶液系統的蛋白質純化一些與水混合多聚物的不相溶性導致依賴于多聚物濃度的兩相系統的液-液分配技術,可以由兩不同的高水溶性的多聚物或一種多聚物各一種鹽,用于從微生物勻漿中除支細胞碎片、后續分配步驟進一步純化。分離的選擇性一般隨著分離分子或顆粒大小面增加。

14.表面活性

14.1泡沫分離

蛋白質溶液具有表面活性,氣體在溶液中鼓泡,氣泡與液相主體分離,在塔頂富集,達到分離和濃縮的目的。

14.2反膠團相轉移法

反膠團相轉移法是80年代興起的一種新型分離技術,它利用表面活性劑分子在有機溶劑中自發形成的反向膠團(反膠團),在一定條件下將水溶性蛋白質分 子增溶進反膠團的極核(水池)中,再創造條件將蛋白質抽提至另一水相,實現蛋白質的相轉移,達到分離和提純蛋白質的目的。反膠團中的蛋白質分子受到周圍水分子和表面活性劑極性頭的保護,仍持一定的活性,甚至表現出超活性。由于蛋白質增溶于反膠團與蛋白質所帶電荷及反膠團內表面電荷間的靜電作用及反膠團的大小有關,因而表面活性劑的種類、水溶液的pH值及離子強度等因素均影響反膠團對蛋白質的相轉移。據報道利用AOT/異辛烷反膠團對酵母脂肪酶進行相轉移。

14.3聚合物-鹽-水液-固苯取體系是90年代在國內開發的種新的萃取體系,成功地用于萃取金屬離子及卞果酸脫氫酶等生物活性物質較強的吸附及乳化作用等缺陷,成相容易成相后直接傾出液相即可使液固的相分離,勿需特殊技術處理,不用有機溶劑,無毒性,成相聚合物及鹽對生物活性物質有穩定和保護作用,萃取分離選擇性好消耗低、易于規模放大的分離生隊物活件物質的新技術在聚乙二醇修飾物的聚乙二醇/葡聚糖雙水相萃取體系共價作用:主要用于含巰基酶的純化,通過共價鍵結合在層析介質上,偶聯是可逆的,能還原二硫鍵的低分子化合物洗脫,如空間位阻,可在含變性劑的緩沖液時吸附,如已含二硫鍵,則先用還原劑打開。

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