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技術原理

PCR技術在水產養殖動物疾病診斷中的應用研究進展

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2021-11-10

    水產養殖業作為我國目前發展較快的農業產業之一.受到了越來越多的關注。已經成為全社會的投資熱點。我國作為一個水產養殖大國。2004年水產養殖總產量達到了3209萬噸.占世界水產養殖產量的70%以上.占全國水產品總產量的65%。

    2003年水產品進出I=1總量為443萬噸.進出I=1總額達79.7億美元.其中出口量210.3萬噸.出1:3額54.9億美元.水產品出口額占農產品出口總額25.6%。繼續位居大宗農產品首位。隨著水產養殖業規模的不斷擴大和集約化程度的不斷提高.水產養殖動物疾病不斷出現。在我國,僅蝦和蟹的普通病、寄生蟲病、傳染病、真菌病、細菌病和病毒病等

    就多達30余種[31。自1993年起。我國沿海養殖區大規模爆發對蝦流行病。使其產量猝減60%70%。直接經濟損失每年達35億元人民幣[41。由于常規的水產動物疾病檢測手段存在準確性差、靈敏度低、耗時長等缺點.很難滿足養殖生產者的需求。而現代分子生物技術中的聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction.eCR)就能很好的解決這一問題。目

    前。水產養殖業蓬勃發展。海參、海膽、扇貝等海珍品的海水養殖成為新一輪的投資熱點。因此,PCR技術在水產養殖動物疾病診斷上的應用,對水產經濟動物的健康養殖具有重要的意義。

    1常規PCR及其衍生技術在水產養殖疾病診斷中的應用

    1.1常規PCR的應用

    常規PCR的原理就是根據病毒或其他病原體的已知保守核苷酸序列設計出引物.對待測核酸的特異性片段進行擴增.之后對擴增產物進行電泳分析.通過是否能擴增出特異性條帶來判斷樣品中是否有病原DNAVoytek等【5J根據Proteobaeteria亞綱的7個種的已知16SrRNA的序列.設計出通用引物.通過PCR在水生樣品中檢測出了細菌AmmoniumOxidizingBacteria。Oshima等I6]從海鯉脾中提取出DNA.并從中特異性地擴增出了編碼真鯛虹彩病(Redseabreamiridovirus,RSIV)核糖核酸還原酶小亞基的一段基因。Altinok等從血樣中提取了DNA.并通過魯氏耶爾森氏菌(YersiniaJ1Jckein")的16SrRNA保守序列設計上游引物YER8

    (422F)和下游引物YER10(1010R),檢測出了該病原體,并通過核酸雜交檢測且證實了其準確性。在對蝦白斑綜合癥病毒fwhiteSpotSyndromeVirus.WSSV1的檢測上.Takahashi等等根據WSSVDNA的EcoRI-HindIII酶切片段設計引物.經PCR檢測出了該病毒。薄清如等[91通過PCR技術.檢測到蝦蛄出也帶有WSSV.從而說明其在病毒傳染過程中可能起到了一定的作用。

    1.2RT—PCR的應用

    反轉錄PCR(Reversetranscription—polymerasechainYeaction.RT—PCR)。其原理就是用反轉錄酶將RNA轉錄為cDNA.之后用PCR對cDNA進行擴增雖然對于同一個病原體來說用PCR和RT。PCR都可以進行檢測.但較PCR而言。RT—PCR顯示出了更高的靈敏性。Rhodes等用RT—PCR很容易的從注射了10個單位細菌的組織中檢測出了該細菌.而用基于DNA的常規PCR卻只有在注射了10000個單位細菌的組織中才能檢測出。但從其后的電泳結果來看并非DNA的提取有問題.這就說明了RT—PCR的靈敏性江育林等也用RT—PCR法快速檢測出了桃拉病毒TauraSyndromeVirus.TSV)。陳曉漢等用引物VF和TSVR。充分結合一步法RT—PCR的優點和二溫式PCR的優點檢測出了南美白對蝦桃拉病毒.顯示出該方法耗時短、特異性強、靈敏度高的特點和較高的應用價值。Widada等[131根據諾達病毒fMacrobrachiumrosenbergiiNodavirus,MrNV)基因組的測序數據設計了四對引物.通過四

    對引物的結合.甚至可以從0.15ng組織中檢測出病毒RNA.說明RT—PCR可以用于養殖動物病原體的Et常監測和進一步研究病原體和主體感染及免疫的關系等。Kiatpathomchai等[141根據黃頭病毒(YelloWHeadVirus.YHV)的開放閱讀框3設計了

    兩對引物P64A1一P64S2和P64A1一P64S3.通過RT-PCR和半巢式RT—PCR檢測出了該病毒.而所用的

    材料是蝦的血淋巴.從而解決了把樣品從較遠的地方帶到實驗室的問題Nunan等也利用RT—PCR擴增出了對蝦桃拉病毒(TSV)cDNA上231bp的一個片段。

    1.3定量PCR的應用

    定量PCRfquantitativepolymerasechainreac—tion)技術就是指以外參(樣本與陽性參照在兩個反應容器內反應)或內參(樣本與陽性參照在一個反應容器內反應)為標準.通過對PCR終產物的分析或者是對PCR過程的監測.達到對PCR起始模板量定量的目的該方法很好的解決了PCR只能定性而不能定量的問題。以定量PCR方法觀察病原體的數量變化.可以對病原體的增殖規律有感性的認識。為進一步確定不同時期差異表達基因。以及針對性的研究提供理論依據。目前在水產養殖動物的疾病診斷中已有了應用。蘭永勝等利用定量

    PCR法對對蝦白斑桿狀病毒早期的感染和增殖進行了研究.并通過對26只Et本對蝦的感染情況觀察得到結論:感染對蝦的存活時間與對蝦質量不存在相關性。近幾年來.實時熒光定量PCR(Rea1.timepolv—me:rasechainreaction)受到了很多的關注。其原理是在反應體系中加入熒光基團.利用熒光信號的積累實時監控整個PCR過程.通過標準曲線對未知

    模板進行定量分析。Tang等根據傳染性皮下及造血組織壞死病毒fInfectioUSHypode:rmalandHaematopoieticNecrosisVirus.IHHNV1基因組序列中編碼非結構蛋白的一段基因設計引物1608F和1688R,對該病毒進行了分析。顯示了很好的特異性和敏感性.較傳統方法.該法還有快速檢測大批量樣本的優點。Hirayama等利用Rea1.timeRT.PCR從魚組織中檢測出faquaticbimaviruses)ABVs,實驗結果表明該法的靈敏度比巢式PCR要高10倍。Loisy等用Rea1.timeRT.PCR從牡蠣中檢測出了諾沃克病毒(NorwalkViruS1.并指出了該法在其他材料中的應用潛力Dhar等別利用熒光染料SYBRGreenchemistry的rea1.timeRT.PCR從蝦中檢測出了r和YHVDhar等也利用該法從蝦中檢測出了IHHNV和自斑病毒(whitespotvirus。WSV)。Purce11等用rea1.timeRT.PCR檢測出了傳染性造

    血器官壞死病毒(Infectioushematopoieticnecrosis

    virus,IHNV)。這些充分說明了該法的優越性。

    1.4多重PCR和嵌套式PCR的應用

    從文獻報道的應用范圍上來看.這兩種方法也有一些應用。但是卻沒有上述那些廣泛。多重PCR(Multiplexpolymerasechainreaction)反應原理是在同一反應體系中同時加入多對引物.在同一個反應管中同時擴增多個目的基因.其優點是可以同時檢測多種病原體,從而節省檢測時間和檢測資金。夏春等根據皮下及造血組織壞死桿狀病毒(HepodermalandHematopoietieNecroisisBacu-1ovirus.HHNBV)XIA基因的序列fAB021155)設計了4個多重PCR引物fP1、P2、P3、P4)經電泳檢測出了兩條目的帶,顯示了很高的特異性。通過實驗證明該法的最底檢限為1fg/l,說明了很高的靈敏性.他們也同時檢出了日本對蝦桿狀DNA病毒fPenaeidrod.ohapedDNAvirus,PRDV)和HHNBV。Coelho等設計專一性的引物采用Multiplex.RT.PCR從實驗室養殖的牡蠣中同時檢測出甲型肝炎病毒fHepatitisAvirus,HAV)、脊髓灰質炎病毒(Poliovirus)和輪狀病毒(Rotavirus)。但是天然狀態下感染的卻無法同時檢出.這可能是由于病毒的濃度較少或提取過程中的部分丟失所致Russell等J利用牡蠣Crassostre凸virgin/c凸核糖體大亞基的基因設計引物同時擴增基因組DNA和單孢子蟲.nelsoni、mo3"irtu——和H.costale.的基因,并通過和傳統的組織病理學檢測及RMFI"檢測法的比較.證明了該法的優越性。Tsai——等(2002)通過multiplex.RT-PCR法采用引物9195F/9992R,94F2/R2。和ITSF/28SR同時擴增TSV、WSSV和蝦Penaeusvannamei的基因組.第一次從中同時檢測出了這兩種病毒。

    嵌套式PCRfNestedpolymer——echainreac.tion)原理就是先利用一對引物.擴增包括靶DNA在內的長片段DNA。然后取少量的擴增產物。利用只針對靶DNA的引物再進行第二次擴增謝數濤等(2001)根據WSSV的部分核苷酸序列設計外引物和內引物。擴增顯示,其靈敏度大約為一步PCR的104倍該法能檢測出注射感染2h后對蝦體內的WSSV(此時對蝦外觀正常1。因此在進行斑節對蝦WSSV的早期快速診斷或早期感染研究有著更大的作用

    1.5連環恒溫擴增技術的應用

    連環恒溫擴增技術(1oop.mediatedisothermalamplificati0n,LAMP)。其原理是采可用內部和外部兩對特異引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶。在65c【=左右對核酸進行擴增。短時間內可獲得大量的拷貝。該法具有高特異性、高效性、快速、廉價、易檢測等特點。Savan等【囂]報道說該法已經用于了檢測的病原體包括:遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiell凸tarda)、鲇魚愛德華桿菌(E.ictaluri)、奴卡氏菌(Nocardi凸senolae)、三文魚重要寄生生物Tetracapsuloidesbryosalmonae、WSSV及IHNV。Kono等【刎根據WSSV.DNA序列fAF3690291設計內引物FIP、BIP外引物F3、B3在65c【=進行連環恒溫擴增檢測了對蝦白班病毒.同時通過和套式PCR的比較。其靈敏度比嵌套式PCR高l0倍。擴增時間lh

    也遠遠少與以前的3——4h.說明該方法在水產養殖動物的常規檢測及疾病的早期診斷中有著很大的應用潛力Sun等【蚓用IHHNV基因組DNA設計了四種引物在64c【=恒溫擴增.并通過高靈敏的DNA熒光染料(SYBRGreenI)和焦磷酸鎂對產物進行了肉眼分辨。并證明了其靈敏度為PCR的100倍。2PCR與其他技術的聯用PCR不僅自身可以用來檢測病原體.也可以與其他技術相結合充分發揮其優點例如Sukhum.sirichart[31]等f2002)通過在反應體系中加人標記的dUTP.采用將PCR和酶聯免疫吸附試驗相結合(PolymeraseChainReaction.Enzyme.Linked-Immuno-sorbentAssay.PCR.ELISA1從蝦中檢測出了對蝦肝胰腺細小病毒fHepatopancreaticPar-vovims,HPV),通過比較實驗,說明其靈敏度是

    southe1TI雜交(Southernhybridization)的10倍,是常規PCR的20倍。該法避免了PCR中使用溴化乙錠的缺點.但是它也有實驗成本較高的缺點。Schwab等采用一種從嗜熱菌Thermusthermophilus中提取出的耐熱性的同時具有反轉錄酶和聚合酶活性的酶rTth,與RT.PCR結合建立了DEIA(DNAenzymeimmunoassay)法檢測出了諾沃克樣病毒(Nor-walk.1ikeviruses。NLVs1,由于該法的結果是用數字表示的.這樣也避免了電泳和Southern雜交時人的主觀判斷de1Cerro等【33]等利用基于TaqMan探針的PCR檢測了病原F.psychrophilum.。Heath等【蚓等利用競爭PCR擴增魚類的一種病原體Piscirick.ettsia5almonis的核糖體RNA基因間(IntemalTran.scribedSpacer,ITS)的部分序列,并用DGGE(變性梯度凝膠電泳)檢測到了結果。Rajan等【蚓通過病原體damselaessp.Piscicida的基因序列設計前引物CPSF、后引物CPSR對其上410bp的一個片段進行了擴增并得到了理想的結果.但為了區別與另一種病原體dxtmselaessp.d鍘e.又用到了TCBS(硫代硫酸鹽.枸櫞酸鹽.膽鹽.蔗糖)培養基,結果顯示前者不能生長.而后著可以生長.兩種技

    術間起到了很好的互補作用。另外,還有文獻報道[a6JpCR與分子標記探針等其他技術的聯和應用這些技術之間的聯合應用都發揮了各自的優點.形成了常規方法無法比擬的優勢。

    3存在的問題與展望

    目前.PCR技術已經在水產養殖動物的疾病診斷中得到了初步的應用.并衍生出了一些其他的技術形式通過PCR與其他技術的聯用還解決了一些技術上的難題。但是。在實際的應用過程中還存在一些問題。例如.水產動物養殖生產者缺乏實驗設備或實驗設備不夠先進、DNA萃取過程不當、實驗試劑上的問題等。都會使檢測的結果不夠理想。因此.具有商業價值的針對不同病原體的試劑盒的開發及應用就顯得非常的必要。這類試劑盒的應用將會簡化養殖生產者的檢測過程。并且提供更為準確的檢測結果。由于大規模的檢測會采取很多的養殖樣品.Pantoja等【還建立了通過PCR分析感染了HPV的蝦的排泄物的方法.這樣就最小程度的減少了養殖上的損失為了更加精確的為未知序列的病原體設計引物.Lu等采用差異顯示(diferentialdisplay)技術獲得病毒基因組的相關信息.再根據其設計引物.從而為基于PCR的診斷做好了準備。運用PCR技術檢測樣品時.高質量模板的快速制備至關重要。為快速制備PCR模板,陳新華【矧等采用SolutionI(5mol/L鹽酸胍、0.1mol/LEDTA(pH8.011裂解魚、蝦組織細胞,然后運用經濃硝酸處理過的Silicondioxidef二氧化硅1分離、富集從細胞中釋放出的DNA.從而建立了一種從病毒感染魚、蝦組織中快速制備PCR模板的有效方法。實驗中該方法只用時20min。具有非常大的應用潛力。另外,核酸提取時.從血液中取樣可以達到從同一個體中重復取樣以及在保證DNA的完整性不變的前提下長時間保存樣品,為該方法的應用提供了新的思路【。

    近年來.海水養殖業蓬勃發展。2003年全國水產品總產量4706.1萬噸.其中海水養殖產量為1253.3萬噸,占總產量的26.6%【21。例如魷魚、海水魚等高密度工廠化養殖。刺參的高密度養殖,每年都有較大幅度的增加。在剛開始的幾年里。養殖生產者獲得了較高的經濟收入。但最近幾年卻暴發了如海參化板癥、氣泡病、細菌性潰爛病、盾纖毛蟲

    病、腐皮綜合癥、霉菌病、扁形動物病、后口蟲病等疾病,在山東、遼寧都有不同程度的發病,給海參養殖造成了很大的經濟損失

    21世紀是海洋的世紀.海水養殖業的發展將很好的解決人類對食物的需求??焖?、簡便、靈敏的

    PCR檢測方法為水產養殖動物的疾病診斷帶來了曙光。PCR技術的不斷完善、新的衍生技術的出現以及與其他新技術的聯合應用.將極大的推動水產養殖業的發展。進而對人類解決食物來源及食物安全性等問題產生深遠的影響。

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