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技術原理

PCR反應體系與反應條件的選擇

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2021-11-09

    標準的PCR反應體系:

    10×擴增緩沖液   10ul

    4種dNTP混合物   各200umol/L

    引物        各10——100pmol

    模板DNA      0.1——2ug

    Taq DNA聚合酶   2.5u

    Mg2+       1.5mmol/L

    加雙或三蒸水至  100ul

    PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。

    溫度與時間的設置:

    基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90——95℃變性,再迅速冷卻至40 ——60℃,引物退火并結合到靶序列上,然后快速升溫至70——75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100——300bp時)可采用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

    ①變性溫度與時間:變性溫度低,解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下,93℃——94℃lmin足以使模板DNA變性,若低于93℃則需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性,就會導致PCR失敗。

    ②退火(復性)溫度與時間:退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃——60℃,可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多,引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度:

    Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)

    復性溫度=Tm值-(5——10℃)

    在Tm值允許范圍內, 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合, 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30——60sec,足以使引物與模板之間完全結合。

    ③延伸溫度與時間:Taq DNA聚合酶的生物學活性:

    70——80℃ 150核苷酸/S/酶分子

    70℃ 60核苷酸/S/酶分子

    55℃ 24核苷酸/S/酶分子

    高于90℃時, DNA合成幾乎不能進行。

    PCR反應的延伸溫度一般選擇在70——75℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間,可根據待擴增片段的長度而定,一般1Kb以內的DNA片段,延伸時間1min是足夠 的。3——4kb的靶序列需3——4min;擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增,延伸時間要稍長些。

    循環次數

    循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環次數選在30——40次之間,循環次數越多,非特異性產物的量亦隨之增多。

    聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點;能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷;可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情,用PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑。

    PCR的最早設想 核酸研究已有100多年的歷史,本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術,Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想:“經過DNA變性,與合適的引物雜交,用DNA聚合酶延伸引物,并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。

    PCR的實現 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內復制,只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合適的緩沖體系,DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。

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