實時熒光定量pcr儀,國產品牌性能優越,歡迎在線選購!
PCR儀 > 技術原理

技術原理

影響PCR及熒光PCR的因素:引物

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2021-11-03

   引物的設計和選擇符合熒光PCR的探針并進行設計對于實時熒光PCR尤其重要??梢哉f,不合理的設計意味著絕對的失敗。但是,好的設計并不等于好的實驗結果,影響PCR和熒光PCR的因素非常多,下面擇其重要進行介紹。

    1.引物退火溫度

    引物的一個重要參數是熔解溫度(Tm)。這是當50%的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下,退火溫度足夠低,以保證引物同目的序列有效退火,同時還要足夠高,以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。

    設定Tm有幾種公式。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。大部分計算機程序使用近鄰分析法——從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩定性。所有oligo軟件會自動計算引物的Tm值。在設置退火溫度時可以如下進行:以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度,以2℃為增量,逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。為獲得最佳結果,兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃,就會由于在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同,將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃?;蛘邽榱颂岣咛禺愋?,可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環,然后再根據較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴謹的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。

    2.引物濃度

    引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導致非特異性產物擴增。為了確定引物濃度,可以在260nm(OD260)測量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數的倒數(nmol/OD),通過Beers法則(公式1)計算引物濃度。微摩消光系數可以使用公式2計算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數不同,確定引物的精確濃度必須使用計算的消光系數。這是因為引物較短,堿基組成差異很大。在oligo軟件上可以計算出引物的的消光系數(OD/μmol)和消光系數的倒數(μmol/OD)。

    一般商業合成的引物以O.D.值表示量的多少,在一般情況下,20個堿基長的引物,1個O.D.加100ul水后引物濃度為50pmol/ul(50μM)。也可以用OLIGO軟件,根據引物的的消光系數(OD/μmol),計算出一定的工作濃度下,引物的加水量。

    濃度(μM)=A260(OD/ml)×稀釋系數×消光系數的倒數(nmol/OD)

    舉例:計算某寡核苷酸(溶于1ml水中),取其中的10μl稀釋100倍(加入990μl)水中。在A260處測吸光度為0.2。計算消光系數的倒數為4.8 nmol/OD,代入得:

    濃度=0.2(OD/ml)×100×4.8(nmol/OD)=96nmol/ml=96μM

    3.引物、探針的純度和穩定性

    定制引物的標準純度對于大多數PCR應用是足夠的。部分應用需要純化,以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截斷序列的產生是因為DNA合成化學的效率不是100%。這是個循環過程,在每個堿基加入時使用重復化學反應,使DNA從3'到5'合成。在任何一個循環都可能失敗。較長的引物,尤其是大于50個堿基,截斷序列的比例很大,可能需要純化。

    引物產量受合成化學的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物,使其最終濃度為100μM。也可以用雙蒸水溶解。

    引物的穩定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩定保存6個月,但在室溫(15℃到30℃)僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年,在室溫(15℃到30℃)最多可以保存2個月。

    探針即寡核苷酸進行熒光基團的標記,標記本身有效率的區別。探針標記以后一般應該純化,純度高、標記效率高的探針不僅熒光值高,且保存時間可以高達一年以上。不同的生物技術公司探針標記效率和純度有很大的區別。

    由于反復凍融易導致探針降解,在確認探針質量好的情況下,最好稀釋成2uM(10×),作為工作濃度分裝多支,避光保存。

和小姪女做很舒服_久久精品国产网红主播_中文字幕人成乱码熟女免费_成人a毛片免费播放_午夜五级a片 <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <文本链> <文本链> <文本链> <文本链> <文本链> <文本链>