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技術原理

熒光定量PCR引物和探針設計指南

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2021-11-03

    1.引物設計

    細心地進行引物設計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。下面的指導描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點:

  •     序列選取應在基因的保守區段;
  •     擴增片段長度根據技術的不同有所分別:
  •     sybrgreenI技術對片段長度沒有特殊要求;
  •     Taqman探針技術要求片段長度在50bp——150bp;
  •     避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對;
  •     避免引物自身形成環狀發卡結構;

    典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長,保證序列獨特性,并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交,降低了特異性,而且比短序列雜交慢,從而降低了產量。Tm值在55——65℃,GC含量在40%——60%;

    引物之間的TM相差避免超過2℃;

    引物的3’端避免使用堿基A;

    引物的3’端避免出現3個或3個以上連續相同的堿基。

    為避免基因組的擴增,引物設計最好能跨兩個外顯子。

    2.Taqman探針設計一般設計原則:

    探針位置盡可能地靠近上游引物;

    探針長度通常在25——35bp,Tm值在65——70℃,通常比引物TM高5——10℃,GC含量在40%——70%。

    探針的5’端應避免使用堿基G。

    整條探針中,堿基C的含量要明顯高于G的含量。

    為確保引物探針的特異性,最好將設計好的序列在blast中核實一次,如果發現有非特異性互補區,建議重新設計引物探針。(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)
    設計引物探針

    3.TaqmanMGB探針設計介紹

    MGB探針的優點:

    MGB探針較短(14-20bp),更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區。

    短片段探針(14-20bp)加上MGB后,Tm值將提高10℃,更容易達到熒光探針Tm值的要求。

    MGB探針的設計原則

    探針的5’端避免出現G,即使探針水解為單個堿基,與報告基團相相連的G堿基仍可淬滅基團的熒光信號。

    用primerexpress軟件評價Tm值,Tm值應為65-67℃。

    盡量縮短TaqmanMGB探針,但探針長度不少于13bp。

    盡量避免出現重復的堿基,尤其是G堿基,應避免出現4個或4個以上的G重復出現。

    原則上MGB探針只要有一個堿基突變,MGB探針就會檢測到(MGB探針將不會與目的片段雜交,不產生熒光信號)。因此,在進行SNP檢測時,為了檢測到突變子,即TaqmanMGB不與目的片段雜交,不產生熒光信號,探針目的片段產生熒光信號檢測將探針的突變位點盡量放在中間1/3的地方。

    注意:為了滿足上述要求的4個條件,探針的突變位點可向3’端移動,但突變位點至少在離3’端2個堿基的前方(即必須確保探針的后兩個堿基是絕對的保守),以進行SNP檢測。反過來,若要進行同類檢測,找的是保守片段區,探針中不應有突變位點。若探針即便是只有13個bp,探針仍不完全保守。有幾個突變,突變位點也應靠近探針的5’端,這樣,即便是突變,探針也可與目的片段雜交,產生熒光信號。另一種方法是設計簡并探針,也可達到即使是突變,仍可檢測到突變。

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