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技術原理

PCR產物測序步驟和要求,測序結果如何分析?

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2021-11-01

    PCR技術代替了為測序而反復進行的分子和模板制備步驟。PCR技術與自動測序技術相結合后,它將成為一種最快、最有效的測定核苷權序列的方法。本章主要綜 述各種測模板的制備以及如何完成PCR產物的直接測序。與傳統的將PCR片段入質 ?;虿《鞠啾?,直接序列分析有兩個主要的優點:1)由于它是一個不依賴于生 物體(如細菌、病毒等)的體外系統,因而它更容易標準化(即例于自化2);對于每個待 測樣品,只需測定一個單鏈序列,因而它也就更快和更準確。相比之下,間接測序為 了區別在PCR反應過程中由DNA聚合酶引入的隨機錯朽核苷酸所引起的原始序列 中的突變,以及由體外重組而產生的人工擴增產物,如產生鑲嵌等位基因(混合) 等,每個樣品不得不測定幾個PCR產物的序列。

    不需借助在細菌中就可直接獲得清蜥和準確的序列結果,其難易程度取決 于:1)只擴增靶序列的PCR引物的擴增能力(通常稱為PCR特異性);2用以獲笪測序模板 的方法。與引物物異性及模板制備有關的問題將在下面談到。雖然DNA測序的化學法 (Maxam-Gilbrt)可以用來直接測序,但我們這里僅討論Sanger的末端終止法。

    最佳的PCR條件

    PCR反應的特異性在很大程度上是由寡聚核苷酸引物的序列所決定的。對于特定 的引物組,PCR的特異性可以由于采用最佳的反應條件、退火溫度和PCR緩沖液中的 MgCl2濃度而發生明顯的變化。如果用標準的1.5mM的MgCl2濃度不能得到所需的特異 性PCR產物,我們建議MgCl2的終濃度為1.4∽2.5mM之間,以0.2mM增長率來改變MgCl2 濃度,以選擇最佳Mg++濃度。一個較常遇見的問題是,使PCR特異性達到最高的MgCl2 濃度導致PCR擴增失敗(dropouts)。這可能是由于模板DNA溶液中有較高的EDTA,它隆 低了提供給Taq DNA聚合酶MgCl2量。因此,對于擴增溶解在TE(1mM EDTA)中的DNA, 我們建議用含2.0mM的MgCl2的PCR緩沖液。

    PCR反應的溫度范圍包含有三個不同的恒定期:變性期、退火期和延伸期,還有它 們之間的過渡期。為了獲得用于序列分析的模板或雜交探針的單鏈DNA,通常并不需 要改變參數。

    凝膠純化PCR擴增的靶序列

    如果最佳PCR反應條件不能產生所需的特異性產物,可采用新的寡核苷酸重新進 行擴增,或用凝膠電泳來分離不同的PCR產物,而后再各自重新擴增進行序列分析。 長度不同的片段可以用瓊脂糖凝膠電泳來分離:

    1.片段大小在80-100bp時,可采用3%NuSieve1%普通瓊脂糖或用聚丙烯酰胺膠來 分離。

    2.從膠上切下含所南非PCR片段的薄片。

    3.加入50∽100μlTE浸泡膠片,可反復凍融或放置幾個小時使DNA從膠中擴散出 來。

    4.取少量(1-5%)進行第二次擴增,為得到純凈單一的產物,用于第二次PCR擴增 的凝膠抽提物的量必須少于1ng。

    5.現已發現瓊脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物質。因而,如需重新擴增供Tab聚合 酶測序用的片段,最好用丙烯酰胺電泳分離。

    當用PCR引物擴增幾個同樣長度的相關序列時,如來自幾個新近復制的基因,或 重復序列或保守的信號序列(conserved signal sequences)的同樣顯子,可以通過下 列兩種不同方法來改進電泳分離。1).先用只切割某一模板的內切酶進行酶切,而后 電泳純化完整的PCR產物。2).用可使核苷酸序列不同的擴增產物分開的電泳系統。下 一個部份將討論此類系統中的變性甲酰胺梯度凝膠系統。采用方法一時,必須事先了 解在不同PCR產物中的內切酶位點。

    雜合體的直接測序

    當兩個等位基因由于單一位點突變而產生差異時,用一個PCR引物直接進行測 序,能找出雜合位點。但是,帶有幾個點突變或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一來直接測序,將產生復合序列帶(compound sequencing ladders)。有四種 方法可以確定幾種點突在型并從雜合體中獲得單個等位基因的序列:1).分離不同 的模板;2).在測序之前,利用模板之間核苷酸序列的差異,用電泳技術分離不同的模 板;3).在測序反應中只啟動一個等位基因;4).只擴增一個等位基因。

    測序模板的制備

    與PCR產物的直接測序有關的一些問題是變性后由于擴增片段的兩條鏈可以迅速 結合起來,從而阻止了測序引物與它的互補序列退火,或阻止了引物──模板復合物 的延伸。在測序反應中,模板鏈重新結合使一小部份模析驂與測序從而弱化最終的測 序條帶。為減少此問題,可用改進的標準雙鏈DNA測序法或用PCR制備單鏈模板。

    雙鏈DNA模板

    有兩種不同方法用來制備測序用的模板,目前都已用來測定共價閉環雙鏈質粒模 板的序列。用這些方法來進行PCR產物的測序通常是較困騅的,因為短的線性模板比 團環質粒的雙鏈更易于重新結合。在這兩種方法中,PCR片段可以由凝膠電膠或在電 泳前先進行旋轉透析(Spin-dialysis)純化。

    1.在室溫下,模板先在0.2M NaOH中變性5分鐘,冰凍,加入0.4倍的5M醋酸銨 (pH7.5)來中和反應。立即用四體積的無水乙醇沉淀DNA。在合適的退火溫度下,加入 測序緩沖引物。

    2.在95℃下保溫5分鐘來變性模板,冰浴(或在干冰乙醇中)快速冷卻離心管,以 減少鏈的重新結合。加入測序引物并使反應達到合適的溫度。測序引物在變性前或后 加入都合適。

    單鏈DNA模板

    使用單鏈模板可以避免測序中鏈的重新結合。單鏈模板可以從雙鏈DNA模板經鏈 分離凝膠中制備,或用PCR反應制備。大于500bp的單鏈DNA片段,可從瓊脂糖凝膠中 分離笪到,但它不適合于更短的單鏈。制備單鏈DNA的另一種不同方法是在PCR反應中 使用一個生物素標記的引物,變性后的PCR產物經過一個親合素柱而使兩條鏈得到分 離,只有生物素標記的鏈才可結合到柱上。然而,最簡單的方法是用改進的PCR方 法,用此方法制備既定的單鏈DNA。在這個反應中(不對稱PCR,asymmetric PCR),在 開始的20-25個循環中,兩個比率不對稱的擴增引物產生出雙鏈DNA,當限量的那個引 物耗光后,隨后的5-10個循環就產生出ssDNA。單鏈DNA在約在25個循環后開始出現, 這時限量的引物也幾乎耗盡。經過一個短暫快速上升后,ssDNA就開始如預期的那樣 呈線性積累,這時反應中僅有一個引物存在。各種比率的引物都以這種形式產生 ssDNA。一般對100μlPCR反應體系而言,引物比率為50pmo:0.5pmol,經過30個循環 后,大約可產生1-3pmol的ssDNA。ssDNA的產量可用下列幾種方法來估計:a)。在PCR 反應中,除了加入正常數量的dDNA外,還加入32P-dNTP。取10%的反應產物在薄的3% NuSieve+1%普通瓊脂糖凝膠中電泳,干燥并與膠片一起曝光。b).取5%的反應物來走 膠,轉移到膜上,并用與ssDNA互補的寡核苷酸為探針雜交。ssDNA不能用EB染色來定 量,因為ssDNA有形成二級結構的趨勢且染料的插入在模板中是隨機的。使用不對稱 引物比例的擴增效率比兩種引物均過量80-90%)的擴增效率低(70%)。在實驗中,這可 通過增加PCR循環的次數來彌補。若不對稱的PCR反應不能產生足夠數量的ssDNA,可 以試一試不同的引物比率;b).再加5-10個PCR循環;c).在最后五個循環中多加Tab聚合 酶(2U);d).試一下相反的不對稱引物比率。有時,相反的不對稱引物比率可能給出不 同產量的ssDNA。制備出的單鏈DNA用限量的那個PCR引物或用一個內引物來測序,并 應用常規方法進行摻入測序(incorporation sequencing)或標記引物測序。制備出的 ssDNA鏈可能有一個不連續的5'-末端,但可能在靠近3'-末端不同位點處被切去,這 是由于延伸過程中終止過早所產生的。然而,對于測序反應中所使用的任何一種引 物,只有完整的ssDNA可以用作測序模板。

    最近還報道了另一種方法制備單鏈核酸模板進行直接測序。這種方法包括在一個PCR引物上加入噬菌體的啟動子,轉錄出該PCR產物的RNA拷貝,再用反轉錄酶不測 序。但由于擴增反應后附加了一個酶促反應步驟和限于用反轉錄酶作為測序酶,這種 方法的應用受到很大的限制。

    用不耐熱DNA聚合酶進行PCR產物的測序

    一些不耐熱DNA聚合酶已經用來直接測序體外擴增的DNA。使用Klenow聚合酶,修 飾T7DNA聚合酶(測序酶)及反轉錄酶來測序。

    用Taq聚合酶進行PCR產物的測序

    Tab聚合酶除了用作PCR擴增外,它還是DNA測序的理想的酶。Tab聚合酶具有高度 的延伸能力(processivity),較高的摻入速率,并可用一些核酶類似物如7-Deaza-2' -脫氧鳥苷-5'-三磷酸來解決DNA測序中的壓縮問題。除了這些與T7DNA聚合酶相同的 性質外,它有較高的熱穩定性,使反應溫度可達55-70℃,這可使大量的二級結構解 體??墒?,對于dNTPs而言,它有一個相對高的Km值(≈10-20μM)并缺乏3'-外切酶活 性。當dNTP濃度低于1μM時,它將產生錯配和不正確的終止。瓊脂和瓊脂糖中都有 Tab聚合酶的抑制物,但這些可通過增加測序反應中Tab聚合酶的量(2U-10U)得到部分 解決。當測定插入子的PCR產物序列時時,由噬菌體液裂解制備的靶基因中并不 含有從平板溶解出來的抑制物。

    對帶有強二級結構的DNA進行測序

    帶有強二級結構的DNA測序可能產生兩個問題:1).由于Tab聚合酶不能完全延伸的 模板頻率很高,因而降低了PCR的效率,2.).在測序反應中,壓縮被測DNA序列的長 度。

    研究結果表明:在PCR中使用Tab聚合酶(50-70℃)的高反應溫度足夠解決大部份短 的二級結構。但強的二級結構會產生強烈的抑制作用。這些只能通過加入與dGTP比例 事適的堿基類似物c7dGTP后,才可解決。同樣的堿基類似物也可用在測序反應中,來 解決壓縮問題(compression problem)。Tab聚合酶可以有效地摻入c7dGTP,但不能用 次黃嘌吟核苷作為堿基類似物。同樣的堿基類似物也可用在測序反應中,來解決壓縮 問題(COMPRESSION)。Tab聚合酶可以有效地摻入c7dGTP,但不能用次黃嘌呤核苷作 為堿基類似物。

    PCR擴增DNA測序中涉及到的錯誤

    在原始靶基因序列和由它擴增出的PCR產物之間可能有兩種不一致情況:1).由點 突變引起的差異;2).由體外重組的等位基因引起的差異。點突變引起的差異是由于 每”個循環中每個核苷酸大約有2×10-4幾率發生錯誤摻入。經過30個循環擴增后,每 個PCR產物平均在每400-4000個堿基對內存有差異。這個錯誤摻入的幾率有時比 Klenow聚合酶(8×10-5)更高。體外重組產生的等位基因(shuffle clone)j是鑲嵌PCR 產物,這可能是在以后的循環中由部分延伸的PCR產物造成的,因為它可作為另一個 等位基因模板的引物。由于酶量不足以用來延伸所有的模板,使得在以后的反應循環 中主要積累這些等位基因。除非雜合體中的兩個等位基因在其PCR引物上有幾個不同 位點的差異,這些人工產物進不能檢測出來的。

    當用PCR產物來、測序并從一組相同子序列(consensus sequence)推斷 出各個等位基因的序列時,就必須考慮到這兩種不同類型的錯誤。相比之下,當PCR產物用來直接測序時,由錯誤摻入或鑲嵌而產生的錯誤PCR產物并不影響PCR測序。在 各個PCR產物中由點突變引起的差異與相同序列比是檢測不出的。既使這個突變(如錯 誤摻入)在以一個DNA分子為模板的如單個精子DNA擴增反應的第一個循環中產生,它 也僅占該位點正常核苷酸的25%。對起始DNA模板不止一個的擴增反應,在任一位點上 含有一個錯配核苷酸的PCR產物的頻率低到檢測不出的程度。雖然目前并不很了解鑲 嵌基因形成的條件,但相信這些等位基因是在反應最后幾個循環中積累起來的,因為 這時酶量可能不足以用來延伸所有的模板。除非序列中有非常強烈的二級結構,在某 一特定位點上使鏈延伸終止,結果產生一個單一的人工基因。鑲嵌基因不會影響正常 序列的測定。

    測序反應的自動化

    DNA測序的可重復性使它適合于完全或部分自動化。已有用常規的放射性標記引物,或熒光終止標記或測序引物進行自動化測序的一系列儀器。但是,這些儀器僅使 分析的前半部分自動化,凝膠電泳、讀帶和將序列輸到計算機中用后半部分自動化來 補足。前半部有兩個階段:模板的制備測序模反應,可很容易地進行自動化反應。用 Tab酶進行PCR擴增和直接測序是制備測序模板和測序反應終產物的最有效方法。一旦 使用自動進樣器,就可進行自動化反應,僅電泳分析由人工進行。這對許多一直使用 人工電泳測序反應的實驗室來說,都將從中受益。

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