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技術原理

什么是引物?設計引物的原則注意事項

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2021-10-30

    什么是引物?引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
    什么是引物?

    設計引物應遵循以下原則:

    ①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。

    ②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。

    ③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

    ④避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3’端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶。

    ⑤引物3’端的堿基,特別是最末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

    ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點,這對酶切分析或分子克隆很有好處。

    ⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。
    引物量: 每條引物的濃度0.1——1umol或10——100pmol,以最低引物量產生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。

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