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技術原理

PCR-ELISA技術的原理和臨床應用進展

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2021-10-30

    聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction, PCR)技術自1989年開始被應用于臨床檢驗以來,以其快速、簡便、靈敏等優點很快地成為臨床實驗診斷學的一個技術熱點。目前,已廣泛用于涉及到核酸的科學研究以及臨床疾病的診斷和治療監測。PCR技術雖然作為一種新生的高新技術而代表臨床實驗診斷學發展的又一里程碑,但十多年的臨床實踐表明,傳統的PCR技術本身還存在著一些問題,如產物污染導致的假陽性、不能準確定量等。為了解決上述問題,使PCR技術更適用于臨術檢測,經國內外學者的不懈努力,目前眾多PCR衍生技術和相關技術已應運而生。本文將就國際上普遍接受的,國內SDA批準的Taqman技術、PCR-ELISA技術的原理和臨床應用進展作一簡單介紹。
    PCR-ELISA技術的原理和臨床應用進展

    實時熒光定量PCR技術

    實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出。與常規PCR相比,它具有特異性更強,有效解決PCR產物污染、自動化程度高,同時能對起始模板進行準確定量等特點。

    一、實時熒光定量PCR的原理

    1. 熒光定量PCR反應原理

    實時熒光定量PCR反應是在常規PCR的一對引物之外,加入一個兩端帶有熒光標記的寡核苷酸探針。在探針完好的狀態下,5´端報告熒光基團的激發光被3´端的淬滅熒光基團所抑制。PCR反應過程中,隨著鏈的延伸,Tao酶沿著DNA模板移動到熒光標記探針的結合位置,發揮它的5´→3´外切核酸酶活性,將熒光探針切斷,釋放出報告熒光基團的熒光信號,每合成一個模板,一個報告基團的信號釋放,被釋放的激離報告熒光基團的數目和PCR產物是一對一的關系。通過定量PCR儀定時動態監測每一循環,可以得到樣品實際擴增曲線,找到PCR擴增的對數期。軟件通過標準品的待測品的對數期比較,得到每一樣品模板DNA的起始拷貝數。

    2. 定量原理

    2.1  CT值  表示每個PCR反應管內熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。研究表明,各模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系,起始拷貝數的對數存在線性關系,起始拷貝數越多,CT值越小,反之亦然。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線,其中橫坐標代表起始拷貝數的對數,縱坐標代表CT值。因此,只要獲得未知樣品的CT值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

    2.2  熒光域值(threshold)的設備

    PCR反應前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號,熒光域值是PCR3-15個循環熒光信號標準差的10倍,即threshold=10×Sdcycle6-15。熒光域值設定在PCR擴增的指數期。

    2.3  基線(Baseline)  是指在PCR擴增反應的最初數個循環里,熒光信號變化不大,接近一條直線,這樣的直線即基線。

    二、實時熒光定量PCR的特點

    1  特異性  FQ-PCR具有引物和探針的雙重特異性,故與傳統的PCR相比,特異性大為提高。

    2  敏感性  FQ-PCR的敏感度通常達10²拷貝/ml,且線性范圍很寬,為0-1011拷貝/ml。一般來講臨床標本中病原體的數目為0-1010/拷貝,在此范圍內FQ-PCR定量較為準確,標本不需稀釋。

    3  重復性  FQ-FCR結果相當穩定,同一標本的CT值相同,但其產物的熒光量卻相差甚大。因為域值設置在指數擴增期,在此階段,各反應組分濃度相對穩定,沒有副作用,CT與熒光信號的對數呈線性關系。而當PCR反應進入平臺期后,由于反應體系各組分的耗盡,酶活性的降低及產物的反饋抑制等原因導致產物不再增加。與終點法相比CT值能更穩定,更精確地反映起始模板的拷貝數。同時,因PCR是對原始待測核酸模板的一個擴增過程,任何干擾PCR指數擴增的因素如擴增孔間溫度差異,標本中DNA聚合酶抑制劑的存在,加樣的差異,待測標本中核酸模板的量等,都會影響擴增產物的量,因此,在擴增產物的數量與起始模板數量之間沒有一個固定的比例關系,通過檢測核酸產物很難對原始模板準確定量。

    4  降低產物污染的風險性

    三、FQ-PCR作為定量PCR的爭議

    關于FQ-PCR能否作為一種定量PCR技術,目前存在著兩種完全對立的學派,一派認為:Taqman技術不使用“內對照系統”只能作為一種定性的測定方法,原因是各反應孔的擴增效率是不同的。另一派認為實時熒光定量PCR無需內標,理由是:(1)CT值的重現性好。由于PCR循環在到達CT值所在的循環數時,剛剛進入真正的指數擴增期,此時微小的誤差尚未放大,因此CT值重現性好,即同一模板不同時間擴增或同時間不同管內擴增,得到的CT值是穩定的。(2)由于CT值與起始模板的對數存在線性關系,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線的定量方法,無需做內對照。(3)內標會對實時熒光定量PCR產生不利影響。若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標,則PCR反應變為雙重PCR,雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭,尤其當兩種模板的起始拷貝數相差較大時,這種競爭會表現的更為明顯。由于待測樣品的起始拷貝數是未知的,所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因,傳統定量方法雖然加入內標但仍然是一種半定量的方法。

    PCR-ELISA 技術

    一、原理

    PCR引物5´端標記上地高辛或生物素等非放射性標記物,擴增產物滴加到固定有特異性探針的微孔板上,再加入抗地搞辛或生物素酶標抗體一辣根過氧化物酶結合物,最終加底物顯色,在酶標板上測定OD值判定結果。常規的PCR-ELISA只能作為一種定性試驗,但若加入內標,作出標準曲線也可實現定量檢測的目的。

    二、PCR-ELISA法的特點

    1. 特異性  近似于FQ-PCR,兩者均具有引物和探針的雙重特異性。

    2. 敏感度  較FQ-PCR略高

    3. 可加入內標,監測樣品PCR受抑制情況,監測PCR平均效率,修正實驗數據。

    4. PCR-FLISL法產物污染的風險性相對較大。

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