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技術原理

PCR技術在致病菌檢測中的應用有哪些

作者:張永祥 辛錫龍???發布時間:2020-08-14

    摘要:聚合酶鏈反應 (PCR) 技術以其具有的特異性強 , 靈敏度高 , 快速準確 , 自動化高的特點 , 被廣泛的應用于醫學、生命科學、農業科學、環境科學、考古學等領域。PCR 技術的發展為食品病原微生物的鑒定提供了新的途徑 ; 對傳染性病原菌的診斷提供了快速、靈敏的檢測手段。為此 , 對國內應用 PCR 技術檢測致病菌的研究成果作一綜述 , 供同行借鑒。

    關鍵詞  聚合酶鏈反應 ; 致病菌 ; 檢測

    聚合酶鏈反應 (Polymerase Chain Reaction ,PCR) 是 1985 年誕生的一項體外擴增 DNA 的方法 ,具有特異性強、靈敏度高、快速準確、自動化程度高等特點 , 自問世以來 , 已在醫學、生命科學、農業科學、環境科學、考古學等許多領域得到了廣泛的應用 , 并結合其它技術衍出了許多優良技術 , 如反轉錄 PCR ( Reverse Transcription - PCR) 、多 PCR (Multiple Primer PCR) 、不對稱 PCR (Asymmet2ric PCR) 、錯配 PCR (Mismatched PCR) 、原位 PCR( In Situ PCR) 、PCR - RFLP ( Restriction FragmentLength Polymorphism) 、PCR - SSCP ( Single StrandConformational Polymorphism) 、PCR - ASO ( AllelaSpecific Oligonucleitides) 、RAPD - PCR (Random Am2plifiedPolymorphic DNA - PCR) 、DDRT - PCR (Dif2ferential Display RT - PCR) 、定量 PCR、免疫 PCR等。本文對 PCR 技術在致病菌檢測和轉基因檢測中的應用作一介紹。

    1 PCR 技術的原理

    PCR技術原理是在體外合適條件下 , 以單鏈 DNA 為模板 , 以 1 對人工合成的寡核苷酸為引物 , 在熱穩定DNA 聚合酶作用下特異性擴增 DNA 片段的技術。整個反應過程通常由 20——40 個 PCR 循環組成 , 每 個 PCR 循環包括高溫變性 - 低溫復性 - 適溫延伸 3個步驟。方法是首先將靶 DNA 雙鏈加熱變性為單鏈 , 然后加入 2 段人工合成的與靶 DNA 2 端鄰近序列互補的寡核苷酸片段作為引物 , 即左端引物和右端引物 ; 該對引物與互補的 DNA 單鏈堿基互補結合后 , 在有 DNA 多聚酶和 4 種 dNTPs 底物存在的情況下 , 引物沿模板 DNA 鏈 (靶 DNA 單鏈) 按 5’末端向 3’末端方向延伸 , 自動合成新的 DNA雙鏈 , 新合成的 DNA 雙鏈又可作為擴增的模板 ,繼續重復以上的 DNA 聚合酶反應。經過 25——35 次循環 , 可將靶 DNA 序列擴增近百萬倍。

    2 PCR 技術在食品致病菌檢測中的應用

    傳統方法檢測食品中致病菌的步驟繁瑣費時 ,需經富集培養、分離培養、形態特征觀察、生理生化反應、血清學鑒定以及必要的動物試驗等過程 ,并且傳統方法無法對那些難以人工培養的微生物進行檢測。而應用 PCR 技術 , 只需數小時 , 就可以電泳法檢測出 011mgDNA 中僅含數個拷貝的模板序列 ; 用 PCR 擴增細菌中保守的 rDNA 片段 , 還可對那些人工無法培養的微生物進行檢測。利用 PCR 檢測食品中的致病菌 , 首先要富集細菌細胞 , 通常經離心沉淀、濾膜過濾等方法可從樣品中獲得細菌細胞 , 然后裂解細胞 , 使細胞中的DNA 釋放 , 純化后經 PCR 擴增細胞靶 DNA 的特異性序列 , 最后用電泳法或特異性核酸探針檢測擴增的 DNA 序列。

    2. 1  檢測單核細胞增生李斯特菌  單核細胞增生

    李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 是食品衛生中的重要病原菌 , 多通過食品經口感染 , 被列為 20 世 紀 90 年代食品中的 4 大病原菌之一。有關單核細胞增生李斯特菌污染乳制品、肉、禽、蔬菜的研究國內外均有報道。該菌可誘發食物中毒 , 導致李斯特菌病 , 主要引起人類腦膜炎、菌血癥等 , 發病率雖低 , 死亡率卻高達 30 %——70 %。傳統方法從食· 611 · 中國國境衛生檢疫雜志 2003 年 4 月第 26 卷第 2 期 Chin J Frontier Health Quarantine Apr. 2003 , Vol 26 , No. 2品中分離、鑒定該菌約需 1——2 周才能得出結果 ,免疫學方法和基因探針已用于該菌的快速檢測 , 但前者可達到屬水平的特異性 , 后者敏感性差。國外已廣泛將 PCR 技術用于快速鑒定單核細

    胞增生李斯特菌1 ——3 , 國內的報道也不少。楊百亮等 (1994) 通過條件優化 , 建立了快速檢測牛奶中單核細胞增生李斯特菌的試劑盒4 , 并在同年報道了以 1 對位于該菌β- 溶血素基因內的 26bp 寡核苷酸為引物 , 用 PCR 對市售豬肉和牛奶中的單核細胞增生李斯特菌的檢測5 。李氏溶血素 O 基因與內化素基因是單核細胞增生李斯特菌最主要的致病因子與侵襲因子 , 這 2個致病基因的位點均在染色體上。溶血素由 hlyA基因編碼 , 且 hlyA 基因在該菌中保守。姜永強等(1998) 根據發表的單核細胞增生性李斯特菌的重要毒力基因 hlyA 的全基因序列 , 設計引物 , 建立了該菌的 PCR 診斷方法 , 結果顯示擴增可獲得預期 743bp 的片段 , 且擴增具有極好的種特異性。同時 , 實驗結果表明 , 用食品標本檢測時 , 許多復雜成分含抑制 Tag 酶的活性 , 當經過增菌培養 , 并對培養物進行化學抽提 , 去除樣品中的脂類和蛋白質 , 純化的菌體經加熱裂解后直接用作 PCR 反應模板 , 可大大提高檢出率6 。陳倩等 (1998) 應用

    2 對引物 ( HIY1 - 2及 Inl1 - 2) 對 50 件速凍食品經 2次增菌后固相吸附法提取 DNA , 分別用 PCR 檢測單增李斯特菌的溶血素 O 基因及侵襲因子內化素基因 , 結果表明 , PCR 法快速準確檢測標本陽性率為 12 %7 。陳偉偉等 (2000) 用 PCR 法對福建省內的 6 類食品 (生肉、熟肉制品、乳、蔬菜、水產品及冷飲) 總共 265 份樣品進行了李斯特菌 2 種致病因子的檢測 , 結果表明總陽性率為6. 42 % ,污染程度最嚴重的是生肉 (23. 33 %) ,其次為水產品(3. 33 %) 8 。實驗證明先將標本增菌接種平板培養 , 然后提取 DNA 作 PCR 測定 , 從每 ml 牛乳或每 g 牛排中檢獲 0. 1cfu 的單增李斯特氏菌9 。

    2. 2 檢測金黃色葡萄球菌 

 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 是各種類型感染和食物中毒的病原菌 , 能在食物內增殖并產生體外毒素 - 腸毒素 (SE) 、內毒素 - 中毒休克綜合征毒素 (TssT1)和脫皮毒素 (ETA、ETB) 。金黃色葡萄球菌腸毒素是 1 種可溶性耐高熱蛋白 , 根據血清型別不同 , 分為 A、B、C、D 和 E5個型。所有的金黃色葡萄球菌腸毒素都有一個相同的基本結構即含有二硫鍵和單一多肽鏈。其中腸毒素 D (SED) 的基因位于質粒上 , 由 256 個氨基酸殘基組成 , 基因長為 774 個堿基對 , 已全部定位。目前金黃色葡萄球菌腸毒素 D 的鑒定主要是依賴于免疫學技術 , 該技術需要細菌純培養和制備腸毒素 , 實驗周期長、步驟繁多 , 使其在食品衛生學鑒定時受到限制 , 近年來 PCR 技術的發展為食品病原微 生 物 的 鑒 定 提 供 了 新 的 途 徑。云 泓 若 等(1999) 選擇 SED 基因的第 360——381 堿基為上游引物 , 第 654——675 堿基為下游引物 , 應用 PCR 技術擴增出 SED 基因的 316bp 長的 DNA 片段 , 并建立了直接利用細菌裂解液作為模板的 PCR 方法10 。

    2. 3 檢測沙門菌

    沙門菌是一種人畜共患的傳染

    性病原菌 , 近年來 , 對沙門菌快速診斷的方法已有了很大進展 , 如應用 ELISA 法、EIA 技術 , 間接血凝抑制試驗、HRP - SPA 染色法和 PCR 技術等。毫無疑問 PCR 技術由于具備高度特異靈敏和快速的特點 , 已引起越來越廣泛的重視。FadI 等 (1995)應用 PCR 技術檢測沙門菌 , 特異性達 100 %11 。沈孝民 (1997) 用 PCR 技術對各種不同血清型的沙門菌和已知被該菌污染的魚粉和動物產品的肉湯培養物進行了檢測 , 結果顯示該方法特異性高 , 且靈敏、快速 , 可檢出 0105pg 水平的 DNA , 并可在1d 之內完成12 。

    2. 4  檢測致病性大腸桿菌
 腸毒素大腸桿菌(ETEC) 是引起嬰幼兒和幼畜腹瀉的主要病因之一 , 該菌可產生 2 種腸毒素 : 熱敏性腸毒素 LT 和耐熱性腸毒素 ST , 它們均能引起腸粘膜細胞水與電解質的代解紊亂并導致腹瀉。ETEC 引起的腹瀉主要是食入了被該菌污染的食品所致。PCR 技術為臨床和實驗室提供了一個更為快速靈敏的檢測手段。王嘉福等(1997) 根據 LT和 ST基因序列 , 合成了引物 , 并對 128 份食品樣品中 ETEC 腸毒素基因 (LT和 ST) 片段進行擴增 , 結果共有 15 個樣品被檢出污染了 ETEC , 并且證實用于擴增的引物具有高度特異性13 。盧林耿等 (1999) 用 PCR 法檢測大腸桿菌 O157 的志賀樣毒素基因 , 實驗表明引物具有高特異性14 。

    2. 5  其它致病細菌的檢測

    目前已建立了應用PCR 方法檢測多種致病菌的方法 , 如大腸桿菌、類大腸桿菌、軍團菌屬、志賀菌、沙門菌等 , 但除了水樣外 , 其它樣品的細菌 PCR 檢測方法未見報道。一般用PCR 擴增β- 半乳糖苷酶 (lacZ) 基因檢測中國國境衛生檢疫雜志 2003 年 4 月第 26 卷第 2 期  Chin J Frontier Health Quarantine Apr. 2003 , Vol 26 , No. 2 · 711 ·水樣中大腸桿菌類 , 用擴增的β- 葡萄糖醛苷酶(Mid) 基因檢測 1 種大腸桿菌和志賀菌屬15 。段廣才等 (1994) 根據霍亂弧菌腸毒素基因 ctxA 和大腸桿菌腸毒素基因 eltA 序列設計了 1 對引物 , 建立了從水樣中檢測 ctxA 的 PCR 快速鑒定方法16 。

    3  應用 PCR 技術檢測轉基因產品

    自 1983 年第一株轉基因植物誕生以來 , 轉基因作物源源不斷地走出實驗室進入大田并商品化 ,并作為食品原料進入食品市場。目前 , 轉基因的檢測方法主要是 PCR 和 ELISA。ELISA 法檢測轉入基因的蛋白表達 , 靈敏度較低 , 而 PCR 法適合于各類樣品包括原料和經過加工的食品。但是 , 盡管能通過 PCR 等檢測技術來鑒別是否為轉基因產品 ,但該食品若經深加工后結構有了很大的變化 , 就很難定性、定量地確定 , 而且轉基因食品的安全性還不能單憑上述檢測結果來判定17 。曹際娟等 (2001) 應用熒光定量PCR儀對轉基因玉米及其粗加工食品如爆玉米花、熟玉米棒、速溶玉米片中通常通入的基因構建元件 35S 啟動子、NOS終止子和外源抗蟲 CryI A (b) 目的基因進行了檢測 , 對轉基因玉米的檢測低限可達到 0. 1 %18 。陳家華等 (2001) 應用 PCR 技術 , 建立了檢測轉基因抗草甘膦油菜籽中草甘膦氧化還原酶基因的技術和方法19 。覃文等 (2001) 運用 PCR 技術 , 以 Gene Scan法代替瓊脂糖凝膠電泳 , 建立了一套準確、快速的檢測轉基因產品的方法 , 檢測了轉基因大豆的 35S啟動子、NOS 終止子和抗除草劑 (草甘膦) 3 種轉基因成分 , 檢測了轉基因玉米的 35S 啟動子和抗蟲(Cry) 2 種轉基因成分 , 結果顯示 , 該法靈敏度高 ,重現性好 , 假陽性少 , 是分析檢測轉基因產品的一種實用方法20 。

    總之 , 由于 PCR 技術可以快速特異地擴增任何期望的 DNA 片斷和目的基因 , 因而在食品檢驗領域有重要的實際應用價值。但在實際應用中也存在一些問題 , 如極少量外源性 DNA 引起的污染可能導致假陽性出現 ; 實驗條件不當導物產生突變 ;引物設計及靶序列選擇不當可能降低靈敏度和特異性等21 。盡管還存在著一定的問題 , 相信隨著該技術的進一步普及、發展和完善 , PCR技術將會得到更加普遍的應用和發揮更大的作用。

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