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技術原理

孫雷:我對新冠病毒測序工作的思考

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2020-05-29

    在此次新冠病毒疫情的發現和防控當中,包括基因測序、RT-PCR在內的病原檢測技術做出了有目共睹的貢獻,也接受了前所未有的壓力和挑戰。這篇文章總結了病原核酸檢測在此次疫情中發揮的作用,以及個人對病原測序行業未來的一些思考。

    新冠病毒的發現

    新冠病毒

    (圖片來源:網絡)

    毋庸置疑,基因測序技術在此次新冠病毒的發現中起了非常關鍵的作用。

    首先,復旦大學張永振團隊從一位病人的肺泡灌洗液樣本中提取病毒,通過二代測序準確地測定了病毒的基因序列,上傳到GenBank,并指出了它和SARS病毒的相似度(Wu et al, “A new coronavirus associated with human respiratory disease in China”)。

    接著,中科院武漢病毒所石正麗團隊通過對5個病人樣本的測序判定病毒和來自蝙蝠的BatCoV RaTG13病毒序列更為相近,但和SARS病毒有同樣的ACE2 cell entry receptor。同一團隊設計出了正確的qPCR原理檢測方法(Zhou et al, “Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin”)。這為迅速判定疫情和對病人確診打下了基礎。

    此后,中國疾控中心譚文杰團隊使用三種測序方法(Lu et al, “Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding”)分析了病毒的變異位點和進化樹。

    至此,我國科研單位在差不多一個月之內迅速發現了正確的致病病毒并完成測序,和全世界分享了病毒的序列和已知變異,給出了有效的核酸擴增熒光定量檢測方法。這些工作都得到了各國政府和世界衛生組織WHO的高度評價。

    在這些發現新冠病毒的工作中發揮出色的是mNGS(metagenomics next generation sequencing,宏基因組測序)技術。發現新病原的關鍵在于高通量和準確率。因為新病原在樣本中的豐度和序列未知,因此為從大量的背景核酸中判定新病毒數據,必須要有足夠的reads數來支持生信分析。

    從復旦張永振團隊的文章可以看出,為了拿到未知病毒120K準確的Reads,整個metagenomics測序通量達到了50M以上(多余DNA序列來自人和其它微生物)。

    從文中還可以看到病毒測序的覆蓋率很不均勻,這個現象可能和逆轉錄或擴增的偏好有關,會提升了數據量要求和序列組裝的難度。高準確率的重要性對de novo測序毋需多言。在沒有準確reference提供比對依據的時候,原始數據的準確率對組裝至關重要。二代測序優秀的通量和準確率在此得到充分的體現。

    對于三代測序(單分子測序)而言,其優勢在于通過減少擴增來達到更均勻的基因組覆蓋和更真實的病原豐度排序。病人樣品里的病毒RNA豐度非常有限,而且RNA在樣本儲存,提取和逆轉錄過程中會進一步損失。

    因此現在所有的mNGS測序方法都必須經過兩次擴增:第一步是cDNA文庫PCR, 第二步是測序前的RPA/RCA擴增或橋式PCR。病原單分子測序工作只需要文庫制備后的擴增,對cDNA的擴增也必須優化以盡量減少偏好性。

    國內的科研機構和科技企業已經在積極開發針對新冠病毒測序的三代測序方案,其中包括中國疾控中心的Nanopore測序方案,真邁生物基于GenoCare測序儀的單分子測序試劑盒,以及貝瑞基因基于PacBio Sequel-II測序儀的單分子測序試劑盒。

    值得一提的是,單分子直接RNA測序在未來是一個很有潛力的病原測序途徑?,F在它的準確率和讀長仍和cDNA測序有一定距離,但是這一方法可以直接測量病毒RNA堿基的修飾(Viehweger et al, “Direct RNA nanopore sequencing of full-length coronavirus genomes provides novel insights into structural variants and enables modification analysis”)。我們期待在這個方向上有更多的成果來闡明RNA修飾在病毒中的作用。

    新冠病毒的核酸檢測

    新冠病毒的核酸檢測

    新冠病毒的主流核酸檢測方法無疑是熒光定量PCR,但這里我不贅述PCR的技術細節。最近大家意見比較多的一個問題就是熒光PCR的假陰性率高,然后是操作時間過長,最后是對于不同樣品的敏感度。

    這幾個問題跟癌癥早篩面臨的問題相似。假陰性和操作時間其實是互相矛盾的。速度越快,擴增效率越低,陽性率會越差。平心而論,熒光PCR的使用還是非常成功的。

    核酸檢測的假陰性問題雖然要盡量解決,但分子診斷中由于檢測限和樣品質量問題出現假陰很難避免。導致檢測錯誤出現的因素是多方面的,網絡上已有專業人士對此進行充分的技術普及,這里我只想說一下病人樣品種類這一點。

    最近深圳市第三人民醫院的研究顯示,痰液樣品的陽性率大大超過咽拭子這樣的固體樣品(Yang et al, ”Evaluating the accuracy of different respiratory specimens in the laboratory diagnosis and monitoring the viral shedding of 2019-nCoV infection”)。 在核酸檢測方法上,進一步優化樣品采集方式可能是最值得做的工作。

    其它檢測方法中,等溫擴增和免疫檢測雖然更快,但特異性和檢測限相比于熒光PCR沒有優勢;CT檢查則難以做到規?;膹V泛使用。

    這次疫情對中國的體外診斷行業是一個巨大的考驗。為了幫助醫院盡快診斷,做好診斷,上百家企業在春節期間加班加點趕制檢測試劑盒和儀器。這種“飽和式救援“保證了節后的試劑盒供應充足,也把整個產業鏈推到了極限。

    我們應當對中國IVD行業整體的快速響應和努力付出感到自豪,同時也期待在以下方面能有更大的提升:

    核心原料的產能和質量還要進一步提高。大部分的IVD公司都只有設計試劑盒的能力,而沒有提供試劑原料的能力。這些原料的產量和質量對檢測試劑盒的性能是至關重要的,國內的原料供應鏈企業在此次疫情中也暴露出了極限生產時的速度和供貨困難。

    如果一些IVD企業在擁有檢測方法的同時也具備核心原料的自主制備能力或產業鏈布局,可以期待它們能夠更從容地應對突發疫情,在趕進度的同時保障試劑的供應和質量。

    快速檢測的技術儲備需要加強??焖贆z測雖然不一定最準確,但是它對于基層醫療機構確實是有價值的。

    現在這些快速檢測產品的供應商大部分都還是比較年輕的公司,在當前的競爭中相比于PCR企業處于劣勢。但是幾年之后,他們可能就會像行業的前輩們一樣積攢足夠的商譽,像等溫擴增試劑檢測盒這樣的產品會得到更多的應用。

    現在幾種主流的核酸快檢方法,如RPA、SHERLOCK和LOOP,都是試劑比較復雜的體系。國內的廠商大多需要自己做試劑和儀器,而不是像PCR行業一樣有比較可靠的產業鏈提供試劑,有通用的實時熒光定量PCR儀可以借助。

    可以預見,下一步核酸快檢會得到更多的支持,類似于PCR的產業鏈和通用儀器會形成,下一次傳染病危機中快檢產品的開發速度和質量都會提高。

    新冠之后的病原測序

    如上所述,測序對于病毒的發現和研究(包括分類,溯源,蛋白研究,疫苗開發)非常重要,但是在診斷中就沒有大量用到測序。第一,畢竟測序太貴;第二,測序需要的樣本量高;第三,測序需要的時間相對更長。

    那么,這次疫情之后測序儀在醫院的應用會不會加速?答案是:可以預期。具備測序儀制造能力的企業都會推動其產品在病原測序方向的報證,測序儀在醫院的投放會增加。但也可以預計,只有科研能力強的醫院會真正做病原變異和微生物宏基因組方面的工作。

    大部分三甲醫院主要還是用更加簡便和快速的核酸檢測方法測已知病原,它們可能會更多的把力量花在qPCR能力、快速檢測設備以及生物安全防護能力的提升上。而對于未知病原的測序,將更多的還是由CDC和中科院病毒所這樣的機構去實施。

    那么第三方檢測機構會不會購買更多的測序儀呢? 很有可能。以后可能會形成醫院做常見病原的PCR檢測、第三方檢驗機構做疑難感染病原測序的分工。第三方檢驗機構的測序一定要能夠給出一個廣譜的病原鑒定結果。

    所以相應病原測序產品的通量要高,病原數據庫要大。至于它是否有醫療器械證反而不一定很重要。廣譜病原檢測的醫療器械證用什么標準審批也是一個問題。國家藥監局需要制定新的規范和標準盤。

    此次疫情以后,國家必定會采取一些措施防止疫情重現,提升抗疫能力。其中和測序相關的一些可能的舉措有:

    長期監測傳染病高發地點的病原分布,提前預警:這包括海鮮市場,肉類批發市場,人群聚集場所這些地點。疾控部門的檢測會突破現有的已知病原范疇,進入未知病原的預警和疫苗目標的預判工作。樣品可能會交由第三方檢驗機構進行測序。

    追蹤病毒變異:歷史上強傳染性病原變異重現非常普遍。如2009H1N1流感病毒在美國爆發,變異后擴展到全球,一直到現在還會傳播 (Ref:https://www.cdc.gov/flu/pandemic-resources/2009-h1n1-pandemic.html)。

    哪怕是比較小的變異也可能會對病毒的傳染性造成很大影響(Maurer-Stroh et al, “A new common mutation in the hemagglutinin of the 2009 (H1N1) influenza A virus”),因此疾控部門的病原測序會成為長期的工作。

    加強儲備針對冠狀病毒的藥物和疫苗技術:冠狀病毒已經給中國帶來了SARS和COVID-19兩次大規模的疫情,這表明我國人群對冠狀病毒可能有一定的易感性。

    因此,即使是在此次新冠疫情結束之后,也需要持續開展針對冠狀病毒的藥物開發,尤其要對一些現有藥物做進一步的測試和評估,把它們推過安全性驗證階段,可能成為未來抗疫立刻可用的武器。

    在預防方面,針對冠狀病毒的廣譜疫苗的開發勢在必行,開發中必須繞開高頻變異位點,兼顧相似病毒。

    監測醫院病原環境,控制院內交叉感染:高達40%的院內傳染率(Wang et al, “Clinical Characteristics of 138 Hospitalized Patients With 2019 Novel Coronavirus–Infected Pneumonia in Wuhan, China”)是造成這次疫情擴大的一大原因。

    歷史上病毒/細菌交叉感染也是重癥的一大來源,對醫院、社區診所的定時病原監測很有意義。

    不過這不會是一件容易的事??梢韵胂?,由于醫院氣溶膠環境的復雜性,測序檢出的結果將是一個很長的微生物清單,如何從中得到有效的解讀將是一個不小的挑戰。但我仍然認為值得去做。

    我們現在所熟悉的PM2.5指數也不是從來就有,但關注的人多了就會天天測,而且成為污染治理的一個標準。微生物測序也可以提供一個類似的引導。此外,如果能開發出一種能夠直接從空氣中取氣溶膠病原樣品測序的儀器,將會非常有價值。

    以上僅是我對病原測序行業未來發展的一些個人思考。作為一名在基因行業里超過20年的從業者,我想說的是,雖然此次新冠抗疫之戰使得基因檢測技術成為大眾矚目的焦點,但最好的技術并不是用來贏得戰“疫”,而是用來防止戰“疫”的出現。這才是我們投身于基因科技的初衷。

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