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技術原理

新型冠狀病毒核酸檢測方法有哪些

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2020-05-28

    臨床上最常用的病原體快速檢測技術主要包括兩大類,即核酸檢測和抗原抗體檢測(我們在前期的文章中進行過梳理)。核酸(DNA或RNA)作為病毒的遺傳物質,任何物種都有獨一無二的核酸序列,對樣本中核酸特征序列進行檢測便可確定病原體。目前,核酸檢測方法主要包括PCR法、恒溫擴增法、測序法、CRISPR檢測法等。

    數字PCR法

    數字PCR技術是第三代PCR技術,是一種核酸分子絕對定量的檢測方法?,F階段,核酸分子的定量有三種方法:光度法基于核酸分子的吸光度來定量;實時熒光定量PCR基于Ct值,即指可以檢測到熒光值對應的循環數;數字PCR作為最新定量技術,主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法,借助專門設備將50微升左右核酸溶液樣本大量稀釋后,分割成了近10萬個液滴分散至芯片的微反應器或微滴中,單一液滴為獨立反應單元,每個反應器的核酸模板數少于或者等于1個。

    經過PCR循環擴增后,有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號,沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積,就可以推算出原始溶液的核酸濃度,從而實現樣本核酸分子絕對定量,即直接計算出核酸數量。

    數字PCR法和熒光PCR法的關鍵區別在于檢測結果的絕對定量和相對定量差異。據了解,現階段數字PCR試劑和機器相價格加高(一臺儀器近百萬元),在SARS-CoV-2快速檢測中的優勢并不大。

    不過,由于具備自動化程度更好、耗時更短等技術優勢,國內多家掌握了數字PCR技術的核酸試劑研發企業正在嘗試開發適用于SARS-CoV-2檢測的相關試劑盒。

    測序法

    測序法可直接解讀出核酸堿基的排列順序,對于一個完全未知的新病毒來說,測序是必須的。測序技術雖然早在1977年就已發明,并在“人類基因組計劃”末期突破重要技術瓶頸開始迅猛發展,仍只有少數企業研制出新型冠狀病毒核酸測序試劑盒并投入生產。

    CRISPR檢測技術法

    基于CRISPR的檢測技術是一種新的新冠病毒RNA檢測,僅需純化的核酸分子樣本,通過簡單三步即可在1個小時的時間里完成檢測。張峰團隊在SARS-Cov-2疫情進展后不久曾公開發表過一項基于該技術的核酸檢測方法。

    他們的主要工具是Cas13a切割酶和針對靶序列設計的兩條gRNA,一條針對S基因,一條針對Orf1ab基因。理論上,只要樣本里有SARS-Cov-2病毒相應RNA,gRNA就會引導Cas13a去切割靶RNA,所以陽性組會出現兩條片段,而陰性組則僅有一條對照條帶。不過,張峰團隊的這項成果還處于臨床研究中。

    恒溫擴增法

    恒溫擴增技術避免了熒光PCR法中對樣本實施的溫度調整,主要涉及2類技術,一類是利用特殊酶取代了PCR中高溫解鏈的步驟,比如LAMP技術中的鏈置換DNA聚合酶和RPA中的重組酶、單鏈結合蛋白和鏈置換酶;另一類技術則涉及DNA和RNA之間相互轉換來擴增,比如NASBA和TMA用到的逆轉錄酶和RNA聚合酶。

    熒光PCR技術是新冠病毒檢測方法的主流方法,也是目前官方認可的SARS-CoV-2測定方法。熒光PCR步驟是指在反應體系中加入了熒光物質,通過專門儀器實現實時熒光檢測,并對模板進行定量計算。為了增加靈敏度和特異性,熒光PCR法出現了不少改進版本,包括Taqman探針法、雙重或多重熒光PCR等。熒光PCR法2-3小時完成核酸檢測。

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