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技術原理

熒光定量 PCR 為什么使用外標定量,而不是內標定量?

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2020-05-25

    1、內標對實時熒光定量 PCR 的影響

    若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標,則 PCR 反應變為雙重 PCR,雙重 PCR 反應 中存在兩種模板之間的干擾和競爭,尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時,這種競爭會表現得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的,所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因,傳統定量方法雖然加入內標,但仍然只是一種半定量的方法。

    2、熒光定量 PCR 無需內標定量

    實時熒光定量 PCR 技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限,實現了每一輪循環 均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品 Ct 值的計算,根據 標準曲線獲得定量結果。實時熒光定量 PCR 無需內標是建立在兩個基礎之上的:

    (1)Ct 值的高度重現性 PCR 循環在到達 Ct 值所在的循環數時,剛剛進入真正的指數擴增期(對數期),此時微小誤差尚未放大,因此 Ct 值的重現性極好,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增,得到的 Ct 值是恒定的。

    (2)Ct 值與起始模板的線性關系由于 Ct 值與起始模板的對數存在線性關系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定, 因此,實時熒光定量 PCR 是一種采用外標準曲線定量的方法。

    外標法定量和內標法定量的方法學比較,得出的結論是:內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的,而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方法。

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