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技術原理

熒光定量PCR技術在臨床肺結核防治中的應用

作者:王式春 劉渠 徐亞???發布時間:2020-05-12

    目前結核病仍是全球性的重大公共衛生問題之一。全球現有肺結核病人2000多萬,其中95%在發展中國家,我國是22個結核病高負擔國家之一,活動性肺結核患者居世界第二位,每年因結核病死亡的人數達劍15萬人,給國家和社會帶來沉重負擔,嚴重影響我國經濟和社會的發展。

    結核分枝桿菌的實驗室檢測是結核病診斷和治療轉歸確認的重要依據。提高實驗室檢測能力,促進早診斷、早治療是有效控制結核病蔓延的必要措施。目前臨床以集菌培養和染色鏡檢法為主要的實驗室檢測手段。大量研究表明,傳統方法的檢出率低、培養周期長,難以滿足臨床需要。熒光定量PCR是近年發展起來的一種重要的基因診斷技術,具有靈敏度高、特異性好、可定量、污染少、易于標準化等優點,得到了廣泛的應用[4-5]。本研究建立了熒光定量PCR檢測臨床結核分枝桿菌的方法,并對熒光定量PCR在臨床肺結核診斷和療效評估中的應用進行了評價,現將結果報告如下。
    熒光定量PCR技術在臨床肺結核防治中的應用

    1. 材料與方法

    1.1 標本

    1.1.1 疑似病人  采集2009——2010年5月到深圳市龍崗區慢性病醫院診斷與治療患者的痰液標本168份,其中男性115份,女性53份,年齡15——60歲。

    1.1.2 確診患者  選擇臨床確診肺結核病人,有低熱、乏力、食欲不振、咳嗽和少量咯血等典型肺結核表現,X線健康檢查肺部有結核病灶,實驗室檢測結果為陽性。為確保樣本采集的連貫性,在爭取病人同意隨訪的同時,選擇暫時在家休養的就近病人。跟蹤隨訪采集深圳市龍崗區慢性病醫院診斷與治療患者漱口后痰液,選取3例活動性肺結核患者,采集病人服藥前1天的晨痰,隨訪中1——7日內每天采集1次,后續間隔2——5天采集1次。

    1.2 儀器  Bact/Alert 3D全自動細菌快速培養和藥敏檢測系統、Heraeus低溫冷凍離心機Megafuge 1.0R、Biospec-mini DNA/RNA/Protein analyzer(島津)、7500熒光定量PCR擴增儀(Applied Biosystems)、凝膠成像系統(英國UVI tec)。

    1.3 抗酸染色法與集菌培養法  操作參考《結核病診斷細菌學檢驗規程》[6]進行。

    1.4 痰液DNA的提取  取0.5ml 痰標本加入2倍樣本體積4%的NaOH,液化10min后15000r/min離心5min,去上清液;向沉淀中加入0.5ml 滅菌水,充分振蕩混勻,15 000r/min離心2min,去上清液,重復洗滌3次;沉淀中加入50 ul DNA提取液(1%NP-40 +2%Triton X-100),充分振蕩混勻,100℃水浴10min;待冷卻至室溫,15 000r/min離心5min,取上清液備用。

    1.5 熒光定量PCR方法

    1.5.1 引物與探針設計  針對IS6110基因設計引物與探針,上游引物:5’-GTC GCC CGT CTA CTT AAT G-3’,下游引物:5’-GCG GAT TCT TCG GTC GTG-3’,產物長度為107bp。探針:5’FAM-CCG ACG GTG CGT AAG TGG GTG CGT CGG-DABCYL3’,由上?;瞪锛夹g有限公司合成。

    1.5.2 反應條件  反應體系(40 ul ):4.0 ul 10 X buffer,7.0mmol/L Mg2+,200 umol/L dNTP,0.2 u mol/L上下游引物,0.2 p mol/L探針,4 ul DNA模扳,2.5U Taq DNA聚合酶。擴增條件:94℃3min,94℃20s,52℃20s,72℃20s,40次循環。試驗設定陽性對照、弱陽性對照與空白對照(no template control,NTC)。按照熒光定量PCR分析軟件設定基線(baseline)與閾值(threshold),以標準品濃度的對數值為橫坐標,Ct值為縱坐標,繪制標準曲線。

    1.5.3 標準品制備 以結核分枝桿菌H37Ra為參考菌株,PCR擴增IS6110基因并克隆刮質粒載體。提取純化重組DNA,10倍梯度稀釋至107Copies/ml 作為強陽性標準品,103Copies/ml 作為弱陽性標準品。

    1.5.4 特異性  以結核分枝桿菌H37Ra為陽性標本,提取牛型分枝桿菌、偶發分枝桿菌、蟾分枝桿菌、草分枝桿菌、龜分枝桿菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、腦膜炎奈瑟氏菌為模板檢測引物與探針的特異性。

    1.5.5 靈敏度與標準曲線繪制  抽提標準品DNA,10倍系列準確定量稀釋102——107Copies/ml 的DNA模板,分別取4ul進行熒光定量PCR擴增。

    1.5.6 結果判定  熒光定量PCR擴增曲線規則,呈對數增長,Ct值≤36即可判定為陽性;如擴增曲線不規則或Ct值>40,報告為陰性;如Ct值在36——40之間,且擴增曲線呈對數增長,樣本重復測定,如Ct值仍在36——40之間報告為陰性。

    2. 結果

    2.1 熒光定景PCR法的特異性  結核分枝桿菌H37Ra出現特異擴增,凝膠電泳出現107 bp條帶。對該PCR產物進行測序,序列分析顯示為結核分枝桿菌核酸序列,其他非結核分枝桿菌擴增結果均為陰性。

    2.2 熒光定量PCR法的靈敏度與線性  以10倍梯度稀釋配制原始拷貝數102——107Copies/ml的標準品系列,取4ul 進行分子信標熒光定量PCR,繪制標準曲線,其回歸方程為Ct=-3.61344 logC0+45.78456,線性范圍為4 X 102——107Copies/ml,r=0.99503,Ct值與DNA模板含量呈線性關系。經多次重復試驗,最低可檢測4 Copies/反應。

    2.3 肺結核的診斷  采集168份疑似結核病人痰標本,集菌培養法和涂片染色法陽性檢出率分別為35.12%(59/168)、12.5%(21/168),熒光定量PCR法陽性檢出率64.29%(108/168),顯著高于抗酸染色法和培養法,漏檢率低。對抗酸染色法和培養法陽性的樣本,熒光定量PCR法的靈敏度分別為100%和95.4%。對于非結核病人來源的痰標本,熒光定量PCR方法檢測結果為陰性,符合率為100%。

    2.4 隨訪檢測  隨訪周期3個月,對5例活動性肺結核進行了動態檢測。熒光定量PCR檢測結果顯示,隨著臨床治療方案的進行,病人晨痰中結核分枝桿菌的數量呈持續下降的趨勢(即Ct值增加)。圖2為隨訪期間連續4次測定病人標本的結果,Ct值分別為26.60、27.58、28.25、29.14,呈連續增加。為保證檢測結果的準確性,每份晨痰都進行平行測定。

    隨訪期間,3例病人轉陰,2例仍為陽性。病例1為男性,23歲,發病時間約2個月,病程較短,病情較輕,治療前X線檢查未見異常,痰涂片檢查:涂陽1+,服藥后在1個月內迅速轉陰,結核分枝桿菌從105copies/ml 減少劍不能檢出。病例2、3、4、5治療前X線檢查均有不同程度的異常,病程較長,患病時問在半年以上。如病例2為男性,41歲,X線檢查右上肺可見斑片狀、條索狀模糊影,密度不均,邊緣不清.其中間見一空洞,無栗粒。痰涂片檢查結果為涂陽3+,診斷為III 型涂陽肺結核患者。經過3個月的治療,4例病人咳嗽、咳痰等臨床癥狀均有減輕。病例2和3涂片與熒光定量PCR檢測結果均轉陰性,病例4、5仍為陽性。圖3為隨訪各病例結核分枝桿菌Ct值隨時間的變化曲線。

    3. 討論

    熒光定量PCR是近年發展迅速的基因診斷技術。與傳統檢測方法比較,熒光定量PCR的陽性檢出率有顯著提高,本研究中熒光定量PCR與傳統的培養法和涂片法的陽性檢出率分別是64.29%、35.12%、12.5%,與文獻報道一。而且熒光定量PCR法極大地縮短了檢測的時間,有助于對病人確診并及時采取治療手段。目前臨床所用實驗室檢測方法十分落后,已成為阻礙我國結核病防治工作順利展開的重要原因,在基層建立和推廣特異性強、靈敏度高的檢測方法非常必要。

    在對5名確診結核病人的隨訪中發現,經過3個月的治療,3名病人痰液中不再有結核分枝桿菌檢出。另2名病人由于感染時間較長,并有較大程度的器質性改變,經過治療雖未很快轉陰,但排出的結核分枝桿菌數量也有顯著減少。在隨訪監測期問,熒光定量PCR檢測結核分枝桿菌的Ct值隨著治療的持續進行呈不斷增加的趨勢(即細菌數量減少),且病人的臨床癥狀均有所緩解。為確保隨訪的持續有效,本次符合的病例較少,對結核病治療效果評價的規律還有待更多研究。但是,本次研究采用熒光定量PCR方法監測結核分枝桿菌變化情況,觀察抗結核藥物的治療進展,并將治療信息反饋給臨床督導醫生的方式,為臨床醫生及時掌握病人的病情和開展后續督導治療提供了動態的數據,在實踐中起到了積極的作用,效果明顯,有重要的臨床意義。

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