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技術原理

豬瘟病毒實時熒光定量PCR檢測方法

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2020-05-11

    豬瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)屬于黃病毒科瘟病毒屬,是豬的一種重要傳染性疾病病原,豬是本病的唯一宿主,病豬和帶毒豬是最主要的傳染源,直接接觸是病毒傳播的主要方式。豬瘟發病特征為發病急,高熱稽留和細小血管壁變性,引起全身廣泛性小點出血,脾梗死,具有很高的發病率和死亡率,對養豬業造成了嚴重的經濟損失,被世界動物衛生組織列為A類傳染病,是國際貿易重要檢疫對象之一(Meuwissen等,1999)。

    目前,CSFV的檢測方法主要有3大類,即兔體交叉免疫試驗、基于病毒抗原和抗體反應的血清學診斷方法和針對病毒核酸檢測的PCR技術(梁仕巖等,2009)。兔體交叉免疫試驗和血清學診斷方法檢測病毒抗原雖然具有一定的靈敏度,但是操作繁瑣,周期較長。PCR可以檢測血液、糞便、分泌物中CS FV的核酸,實現早期診斷,在CSFV的檢測中發揮重要的作用(傅烈振等,1998;張朝紅等,2007;劉建柱等,2003)。近年來發展起來的實時熒光定量PCR檢測技術將PCR與熒光檢測結合起來,克服了傳統PCR的假陽性和不能準確定量等弊端,可對樣本中的核酸進行準確的定量檢測,具有操作簡單、結果直觀、準確定量等優點,已經成為病原體檢測的有效技術。

    1.1.1 毒株 豬瘟兔化弱毒疫苗為廣西獸醫研究所實驗室保存。

    1.1.2 主要儀器和試劑 iCycleriQ熒光定量PCR儀(美國Bio Rad公司)、PCR儀(日本TaKa Ra公司)、凝膠成像系統(美國AlphaInotech公司)、生物分光光度計(德國Eppendorf公司)。RealMasterMix熒光定量PCR試劑盒(SYBR)購自天根生化科技有限公司,DNA膠回收試劑盒、質粒小量抽提試劑盒購自廣州某生物科技有限公司,pMD18 T載體、RNA酶抑制劑(40U/ L)購自大連寶生物公司。Trizol購自美國Invitrogen公司,MLV反轉錄酶(5U/ L)為美國Promega公司產品。1.2 方法

    1.2.1 引物的設計與合成 根據GenBank公布的25株CSFV基因組5 非編碼區基因序列進行同源性比較分析,選擇保守序列區作為擴增區域,利用Oligo6.0引物設計軟件和BLAST軟件程序設計,TM序列為:CSFV 1:5 GCCCATAGTAGGACTAG CA 3 ;CSFV 2:5 CGAACTACTGACGACTGTC 3 ,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。1.2.2 病毒RNA提取和反轉錄 CSFVRNA的提取按照Invitrogen公司的Trizol提取說明進行。按李軍等(2005)介紹的方法進行反轉錄。1.2.3 實時熒光定量PCR條件的優化 在iCy cleriQTM熒光定量PCR儀上進行擴增和數據分析,對不同退火溫度(55——59 )進行優化,然后,以優化的退火溫度分別對不同引物濃度(2.5、5、25pmol/ L)進行優化,確定其最佳引物濃度。1.2.4 熔解曲線分析 為排除非特異性擴增和引物二聚體的形成對實時熒光定量PCR結果造成影響的可能性,在PCR后進行熔解曲線分析以確定引物的特異性和所得產物是否為目的產物。溫度以0.5 /10s的速率從55 緩慢遞增到94 ,連續測定樣品的熒光強度以獲取熔解曲線。反應結束后取6 L產物進行電泳,判斷有無96bp的特異性條帶出現。

    1.2.5 標準品的制備和標準曲線的建立 以優化的反應條件對CSFVRNA反轉錄的cDNA進行常規PCR擴增。PCR產物經3%瓊脂糖凝膠電泳,GelRed染色,凝膠成像系統檢測,在紫外燈下切取目的片段,利用DNA膠回收試劑盒回收純化目的片段。將回收純化的目的片段與pMD18 T載體連接,轉化大腸桿菌DH5 ,用質粒小量抽提試劑盒抽提質粒,經酶切和PCR鑒定后,將陽性重組質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。純化陽性重組質粒,測D260nm值后,將陽性重組質粒進行10倍梯度稀釋,采用優化的反應條件進行實時熒光定量PCR,循環閾值(Ct)設定原則為超過陰性對照擴增曲線(無規則噪音線)的最高點。Ct值>35為陰性,Ct值<35為陽性。熒光定量PCR儀會根據各個標準品測得的Ct值,以樣本拷貝數的對數為橫坐標,以Ct值為縱坐標建立標準曲線。

    1.2.6 特異性、準確性和穩定性試驗 分別提取CSFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環病毒2型共4種病毒的核酸,用優化的反應條件進行熒光定量PCR,檢測本方法的特異性。分別重復6次檢測含量為2.0 106、2.0 105和2.0 10拷貝/ L的CSFV陽性重組質粒,評價本方法的準確性和穩定性。

    1.2.7 實時熒光定量RT PCR的臨床應用 應用4

    的15份樣本中,有6份樣本經兔體交叉免疫試驗證實為豬瘟病毒陽性。2 結果

    2.1 熒光定量PCR條件的優化 分別對退火溫度和引物濃度進行優化,獲得了CSFV的熒光定量PCR最佳反應條件和體系??偡磻w系為25 L,其中RealMasterMix11 L、上下游引物(5pmol/ L)各0.5 L、cDNA模板2.5 L以及ddH2O10.5 L。反應條件:95 預變性5min;隨后進行40個95 20s,57 20s,68 20s的循環;最后68 延伸5min。

    2.2 熔解曲線分析 熔解曲線只有1個特異峰(圖1),排除了非特異性產物和引物二聚體形成對結果帶來影響的可能,同時說明設計的引物具有很好的特異性,PCR反應條件得到了很好的優化。PCR產物電泳結果顯示為單一條帶,大小與預期擴增片段大小一致(圖2),可以判斷PCR為特異性擴增。

    2.3 標準品的制備和標準曲線的建立 CSFVRNA經反轉錄合成cDNA后,進行PCR擴增,PCR產物經膠回收后,與pMD18 T載體連接,轉化大腸桿菌DH5 ,用質粒小量抽提試劑盒抽提質粒,測序結果表明擴增序列與參考序列一致。抽提陽性重組質粒,測D260nm值。根據分子質量及阿佛加德羅常數(6.023 1023分子數/mol)換算為分子拷貝數,按2 1010拷貝/ L濃度的陽性重組質粒進行10倍梯度稀釋,采用優化的反應條件進行實時熒光定量PCR擴增(圖3),當模板濃度為2 10拷貝/ L時,仍有熒光曲線,表明該方法檢測靈敏度為2 102拷貝/ L

    其結果與兔體交叉免疫試驗一致。同時利用其它豬瘟病毒特異性診斷引物對這15份臨床樣本進行了RT PCR檢測,其結果也與實時熒光定量RT PCR的結果完全一致,說明熒光定量RT PCR的準確性達到100%(廖素環等,2005)。
    檢測曲線

    熒光定量PCR的檢測方法有二種,一種是以TaqMan探針為代表的雜交探針檢測,另一種是以SYBRGreen 為代表的染料檢測(Bhudevi等,2001;Mart nez等,2008)。SYBRGreen 染料可以與雙鏈DNA的小溝結合,在波長497nm下發射熒光信號,而且熒光強度的增加與雙鏈DNA的數量成正比,而未與雙鏈DNA結合的SYBRGreen 染料分子不會發射熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步,達到實時定量的目的。與普通PCR相比,SYBRGreen 熒光定量PCR的核酸擴增和檢測都在同一管內進行,無需電泳檢測PCR產物,解決了PCR假陽性和核酸染料溴化乙錠對環境的污染問題。整個檢測過程可在1h內完成,僅為普通PCR檢測時間的一半,從病料到結果檢測只需2.5h,能滿足臨床上豬瘟診斷的快速要求。與雜交探針熒光定量PCR相比,SYBRGreen 染料可以適用于任何基因的PCR擴增,無需設計特定的探針序列,價格成本低廉。

    由于SYBRGreen 染料與雙鏈DNA結合沒有特異性,容易產生非特異性擴增,因此需要優化PCR反應條件和得到單一的熔解曲線來增強檢測的靈敏度和精確度(Simpson等,2000)。本試驗通過優化PCR反應條件,在PCR退火溫度為57 ,引物濃度為5pmol/ L時,獲得的熔解曲線只有一個特異峰,表明了該反應為特異性擴增,沒有引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物的出現。 熒光定量PCR的靈敏度檢測結果表明,本試驗建立的方法最小檢出量為2 10病毒基因組拷貝數/ L。在特異性試驗中該方法與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環病毒2型等常見的豬源病毒不存在交叉反應,說明本方法特異性強。對標準品分別重復6次檢測,結果表明該檢測方法具有良好的準確性和穩定性。將該方法用于臨床樣本的檢測,其結果與兔體交叉免疫試驗的結果一致。因此,本試驗建立的具有高靈敏度和高特異性的熒光定量RT PCR檢測方法能為豬瘟實驗室快速診斷和疫情監測提供一種快速、準確、簡便的檢測。
文章作者:李軍,潘艷,禤雄標,胡帥,馬春霞,謝宇舟,陳澤祥,許力干,謝永平,楊威

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