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技術原理

熒光定量PCR技術的應用

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2020-04-29

    1、絕對定量分析

    這是熒光定量PCR技術的直接應用,可用于檢測病毒及細菌的濃度!
    熒光定量PCR技術應用

    2、相對定量分析及實驗方案

    基因表達(gene expression)是指細胞在生命過程中,把儲存在DNA順序中遺傳信息經過轉錄和翻譯,轉變成具有生物活性的蛋白質分子. 遺傳物質DNA首先要把所攜帶的遺傳信息轉錄成為信使RNA(mRNA),攜帶遺傳信息的mRNA從細胞核進入到細胞質中與核糖體結合,在核糖體中mRNA攜帶的遺傳信息被翻譯成為多肽,多肽經過進一步加工后變成蛋白質,至此遺傳物質DNA完成了表達過程。期間的轉錄過程是基因表達中非常重要的調節步驟,所轉錄的mRNA的多少直接影響著相關最終蛋白質的多少,所以通過對細胞內某條基因mRNA含量多少的分析,就能大致判斷出該條基因的表達是否活躍。

    研究基因表達的情況,我們只需搞清楚該基因在不同生理階段的變化趨勢如何就行了,而無需知道該基因的絕對量有多少?;虮磉_調控研究中,由于RNA純化后得率不同、RNA反轉錄為cDNA的效率不同等客觀因素,用于定量分析的初始樣品濃度不同,這就造成了比較上的混亂,因此在進行基因表達調控研究中都會用一些看家基因來標準化,以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。所謂的看家基因即內參基因,是指在各生理階段表達量恒定的基因,也稱奢侈基因,該基因表達一般不隨外界的變化而變化,所以常被用作參照,常用的內參基因有GAPDH基因、β-Actin基因,18srRNA基因等。因此,在做基因表達調控分析時至少要做兩個基因,目的基因和一個看家基因。

    假定在1生理時期,X基因的表達量為X1;其內參基因表達量為Y1;X1/Y1就將1生理時期的取樣、RNA提取、純化、反轉錄等過程的所有偏差均一化了;同樣在2生理時期,X2/Y2就將2生理時期的取樣、RNA提取、純化、反轉錄等過程的所有偏差均一化了;最后(X1/Y1)/(X2/Y2),所得的值就能就能較為真實的反應在1、2生理時期,X基因的變化情況。

    常用的相對定量方法主要有兩種,雙標準曲線法和Delta-delta Ct法。

    雙標準曲線法

    所謂的雙標準曲線法就是對內參基因和所研究的目的基因都做絕對定量,然后將各生理階段的目的基因的量和內參基因的量相除,得出一個比值;最后再將不同生理階段所得的比值相除,最終得出目的基因在不同生理階段的表達變化。

    雙標準曲線法思路直觀、條理清晰,最大限度的避免了實驗的誤差,是一種很好的分析方法。

    Delta-delta Ct法

    此法是經定量的數學原理推導而來

    該方法直接利用看家基因來校正樣品初始量,但同時默認兩個基因擴增效率一致,而并非真實擴增情況的反映,因此實驗條件需要嚴格優化,并且總會存一定的偏差。在預實驗中,必需對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。軟件會自動給出兩組標準曲線的R值、擴增效率等信息,如果兩組標準曲線的斜率,即M值的差小于0.1,表明兩個基因的擴增效率已非常接近,那么后續實驗中就可以用此法進行相對定量分析。反之,如果M差值大于0.1,就無法用該方法進行相對定量分析。此時的解決方法有兩種,一是優化實驗,使兩組標準曲線的斜率差值小于0.1,二是換用其它的相對定量方法。

    3、SNP檢測分析

    基因組DNA是生物體各種生理、病理性狀的物質基礎。人類眾多個體的基因組序列的一致性高達99%以上,但個體之間各種性狀的差異仍然很大,包括對疾病的易感性、對同一疾病治療藥物的反應性等。在同一生物種群中明顯存在兩種以上不同的遺傳性狀,而且出現頻率較高,稱為遺傳的多態性(polymorphism),而遺傳物質DNA的多態性如RFLP、STR、ABO血型、HLA和單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)是個體間差異的遺傳學基礎。
    SNP檢測分析

    SNPs是指在基因組水平上由于單個核苷酸位置上存在轉換(C與T互換,在其互補鏈上則為G與A互換)或顛換(C與A,G與T,C與G,A與T互換)等變異所引起的DNA序列多態性。SNP是人類可遺傳的變異中最常見的一種,占所有已知多態性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在,平均每500——1000個堿基對中就有1個,估計其總數可達300萬個甚至更多。

    通常所說的SNP都是二等位多態性的,轉換的發生率總是明顯高于其它幾種變異,具有轉換型變異的SNP約占2/3,其它幾種變異的發生幾率相似。轉換的幾率之所以高,可能是因為CpG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類基因組中最易發生突變的位點,其中大多數是甲基化的,可自發地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。

    在基因組DNA中,任何堿基均有可能發生變異,因此SNP既有可能在基因序列內,也有可能在基因以外的非編碼序列上??偟膩碚f,位于編碼區內的SNP(cSNP)比較少,因為在外顯子內,其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義,因此cSNP的研究更受關注。

    從對生物的遺傳性狀的影響上來看,cSNP又可分為2種:一種是同義cSNP(synonymous cSNP),即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列,突變堿基與未突變堿基的含義相同;另一種是非同義cSNP(non-synonymous cSNP),指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質序列發生改變,從而影響了蛋白質的功能,這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。

    根據已知的SNP位點變化設計出兩種不同的探針,一種和野生型完全匹配,一種和突變型完全匹配;每一個樣品都平行的做兩次熒光定量PCR檢測,一次添加野生型探針,一次添加突變型探針;針對特定的SNP位點,進行熒光定量PCR反應。由于SNP位點堿基的不同,所以擴增結果也有差異。探針序列和模板序列完全匹配時,擴增曲線正常;探針序列和模板不完全匹配時,擴增曲線不起跳,或者熒光量很弱Ct值很大;當樣品為雜合子時,由于樣品中含有和兩種探針序列匹配的模板,所以此時擴增曲線幾乎完全重合。這種差異就反映在擴增曲線上。如下圖:
    擴增曲線

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