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常見問題

如何增加RT-PCR特異性?

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2021-11-13

    起始cDNA合成

    第一鏈cDNA合成的起始可以使用三種不同的方法,各種方法的相對特異性影響了所合成cDNA的量和種類。

    隨機引物法是三種方法中特異性最低的。引物在整個轉錄本的多個位點退火,產生短的,部分長度的cDNA。這種方法經常用于獲取5'末端序列及從帶有二級結構區域或帶有逆轉錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。為了獲得最長的cDNA,需要按經驗確定每個RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應體系。因為使用隨機引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA,所以模板一般選用poly(A)+RNA。

    Oligo(dT)起始比隨機引物特異性高。它同大多數真核細胞mRNA 3'端所發現的poly(A)尾雜交。因為poly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2%,所以與使用隨機引物相比,cDNA的數量和復雜度要少得多。因為其較高的特異性,oligo(dT)一般不需要對RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進行優化。建議每20μl反應體系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18適用于多數RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20,因為其熱穩定性較好,適用于較高的保溫溫度。

    基因特異性引物(GSP)對于逆轉錄步驟是特異性最好的引物。GSP是反義寡聚核苷,可以特異性地同RNA目的序列雜交,而不象隨機引物或oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用于設計PCR引物的規則同樣適用于逆轉錄反應GSP的設計(見第五章)。GSP可以同與mRNA3'最末端退火的擴增引物序列相同,或GSP可以設計為與反向擴增引物的下游退火。對于部分擴增對象,為了成功進行RT-PCR,需要設計多于一個反義引物,因為目的RNA的二級結構可能會阻止引物結合。建議在20μl的第一鏈合成反應體系中使用1pmol反義GSP。

    提高逆轉錄保溫溫度

    為了充分利用GSP特異性的全部優點,應該使用有較高熱穩定性的逆轉錄酶。熱穩定逆轉錄酶可以在較高溫度保溫以增加反應嚴謹性。比如,如果一個GSP退火溫度為55℃,那么如果使用AMV或M-MLV在低嚴謹性的37℃進行逆轉錄,GSP所帶有的特異性就沒有完全利用。然而SuperScripⅡ和ThermoScript可以在50℃或更高進行反應,(表2)這就會消除較低溫度時產生的非特異性產物(圖10)。為獲得最大的特異性,可以將RNA/引物混合物直接從65℃變性溫度轉移到逆轉錄保溫溫度,并加入預熱的2×反應混合液(cDNA合成熱啟動)。這有助于防止低溫時分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度轉換。

    圖10. 逆轉錄溫度對RT-PCR特異性的影響

    使用ThermoScript?和設計用來同人DNA聚合酶εmRNA退火的GSP,由1μg Hela RNA合成cDNA。Thermoscript加入到預熱的反應混合液中,使用Platinum Taq DNA聚合酶對1/10的cDNA進行35個循環的PCR。

    減少基因組DNA污染

    RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA。使用較好的RNA分離方法,如Trizol Reagent,會減少RNA制備物中沾染的基因組DNA。為了避免產生于基因組DNA的產物,可以在逆轉錄之前使用擴增級的DNaseⅠ對RNA進行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子,防止高溫時所發生的依賴于鎂離子的RNA水解。

    為了將擴增的cDNA同沾染的基因組DNA擴增產物分開,可以設計分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cDNA的PCR產物會比來源于沾染的基因組DNA的產物短。另外對每個RNA模板進行一個無逆轉錄的對照實驗,以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉錄時所得到的PCR產物來源于基因組。

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