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常見問題

PCR擴增后出現非特異性條帶的原因

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2021-11-09

    PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現,其原因:

    一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。

    二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量,往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現,酶量過多有時也會出現非特異性擴增。

    其對策有:

    ①必要時重新設計引物。

    ②減低酶量或調換另一來源的酶。

    ③降低引物量,適當增加模板量,減少循環次數。

    ④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。

    出現片狀拖帶或涂抹帶

    PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多引起。

    其對策有:

    ①減少酶量,或調換另一來源的酶。

    ②減少dNTP的濃度。

    ③適當降低Mg2+濃度。

    ④增加模板量,減少循環次數。

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