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常見問題

PCR技術詳解:變性、退火、延伸

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2020-08-20

    PCR技術能快速特異地在體外復制目的,理論上能將其量極微的(fg DNA)目的基因在較短的時間內(1-2小時)擴增到極易檢測的微克水平。PCR技術目前已經成為人們獲得目標基因的最常用的方法之一。然而其基本原理并不復雜,主要包括模板DNA(目標DNA)加熱變性;降溫后反應混合物中特異性引物與單鏈DNA模板的復性;72℃條件下,Taq酶誘導引物借助模板信息由5’端到3’端延伸。每一輪反應,模板拷貝數都增加一倍,理論上n次循環后,擴增產物拷貝數為2E(n——1)。但在PCR反應后期由于底物的消耗,Taq酶活力的下降,PCR抑制物的增加,PCR反應的指數形式逐漸轉化為線性形式進入擴增的平臺期,實際上30-35個循環,擴增倍數一般可達百萬倍。如果想再提高pcr擴增產物的量,可以將產物DNA再稀釋1000倍作為新的模板進行第二輪的PCR擴增,一般二次擴增后的DNA數量已達到所有分子生物學操作的要求。

    一、變性

    DNA雙螺旋結構的生物功能在于復制與轉錄,加熱或在堿性條件下可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,形成單鏈DNA,稱之為DNA變性。解除條件后,變形的單鏈DNA可以重新結合起來,再形成雙鏈,稱之為DNA復性,又叫退火。DNA雙鏈離解一半時溫度稱為解鏈溫度(Tm)。不同DNA的解鏈溫度不同,取決于DNA中G-C與A-T的含量的區別。G-C間有三個氫鍵,A-T間有兩個氫鍵,因此G-C比例大的DNA片段解鏈溫度高,一般,G-C含量每增加1%,PCR變性溫度增加0.4℃。Tm范圍通常一般在85-95℃之間,PCR變性溫度選擇94℃,變性時間為30秒到2分鐘。

    二、退火

    PCR反應體系的退火其實是模板與引物的復性。引物是與模板某區序列互補的一小段DNA片段。一般引物是人們根據目標DNA的序列人工合成的,其長度在15-30堿基之間,引物的設計有一定的原則,但完全達到理論要求的理想引物,幾乎不存在。通常反應體系中包含兩個引物所對應的模板區間的DNA片段。由于引物的濃度大大地超出體系中模板的濃度,所以變性后,系統溫度降低,首先是引物與單鏈模板DNA結合,形成局部雙鏈,而不是原來的兩條單鏈模板DNA再結合形成的完整的雙鏈。

    三、 延伸

    PCR中鏈的延伸是有方向的,以引物為起點,從5’端到3’端延伸,這是由DNA聚合酶(Taq酶)決定的。Taq酶具有DNA多聚酶的核心功能—以DNA為模板,從結合在特定DNA模板上的引物為出發點,將四種脫氧核苷酸以Watson-Crick配對方式按5’—3’的方向,沿著模板順序合成新的DNA鏈。Taq酶催化DNA合成的溫度以70℃—80℃為宜,此時該酶的Kcat值為150核苷/秒/酶分子,55℃為24核苷/秒/酶分子,37℃為1.5核苷/秒/酶分子,22℃為0.25核苷/秒/酶分子。高于90℃時DNA合成幾乎不進行。Taq DNA多聚合酶具有依賴DNA合成的5’端到3’端外切酶活性。但不會影響PCR擴增。Taq酶沒有3’端到5’端外切酶活性,所以如果發生脫氧核苷酸的錯誤摻入時,這種酶沒有校正能力。Taq酶對Mg2+離子濃度較為敏感,1.5——2.0mM條件下酶活性最高,許多生物變性劑對酶活性有不同程度的影響。PCR擴增DNA特定區段,是由人工合成的兩條寡核苷酸引物所決定的,這是PCR擴增的理論關鍵。

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