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常見問題

熒光定量PCR體系如何加樣?

作者:捷瑞???發布時間:2020-07-21

    PCR反應體系中,各試劑加樣量是如何確定的,DNA模板怎么提取,PCR體系。這個小小管子里都有什么東西、需要加多少呢?今天一起來看一下關于PCR體系的加樣各種問題。

    關于體系

    PCR技術問世于上世紀80年代。問世之初的PCR體系比較大,動輒以毫升計?,F在的PCR體系要精巧多了,總體積可大可小。我們常接觸到的常規PCR以及熒光定量PCR的體系一般都在幾十微升,小到可以10微升左右。下面是一個10微升的熒光定量PCR體系。
    10微升的熒光定量PCR體系

    早期的PCR體系,里面的組分都是各自獨立加樣的,包括DNA模板、上游引物、下游引物、dNTP、Buffer、MgCl2、聚合酶、水(見下圖)。所以早年間做一管PCR需要加樣7——8次才能加完一管?,F在就簡化多了。除了特異的 DNA模板與引物以外,其他幾種成分可以做到混在一起,做為PCR Mix統一加樣。這樣每個管一般只需做4次加樣操作即可完成,工作量減少近一半。
    PCR mix

    DNA模板來源

    DNA模板一般來自于從組織中提取的DNA、或者從RNA逆轉錄得到的cDNA。很多經驗表明,逆轉錄得到的cDNA一般要稀釋10倍再做熒光定量PCR,這樣得到的CT值會在一個比較理想的范圍內。當然這并不是固定的做法,還要根據你的實際情況來做調整。用于PCR的引物濃度,比較常用的是10 p mol/ul、等于10 uM。注意單位哦。

    PCR mix

    PCR Mix由于已經是現成的,所以你不必調節里面的組分。放心,組分肯定是夠用的。因為在一個PCR體系內,引物和dNTP、酶等都是足量甚至過量的。當然PCR Mix并不是簡單的把那幾種成分一古腦混在一起就行的,里面還需要特殊成分以維持其穩定性。對于熒光定量PCR用的Mix,里面還會預混有熒光染料。
    dna

    如果你對DNA聚合酶有特殊要求,不想簡單的采用PCR Mix,那么你可以單獨選擇你要的那種酶,以及相應的其他組分相配合。

    關于體系中的水

    水是用于補齊總體積的。PCR由于成分多、各成分又有不同體積,所以加起來的總體積可能并不剛好是理論上的總體積。計算總體積一般要參考其中的Buffer的體積。如果是10 x Buffer,那么總體積就應該是10 x Buffer體積的10倍。如果達不到這么多,就加水補齊。如果PCR Mix以及模板和引物的總體積是剛好的,就可不必加水了。

    早年的PCR體系往往還要加另一種成分:液體石蠟油。在PCR總體系配制完成后,最后再在上面加一層液體石蠟油。液體石蠟油比較輕,會漂浮在上面,可防止體系中的水分揮發。這是一種簡單但很實用的做法?,F在的PCR管密封很好,又有完善的熱蓋系統,所以這種做法現在已經不太常見了。

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