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常見問題

熒光定量PCR檢測常見問題與解答

作者:熒光定量PCR儀???發布時間:2020-05-20

    Q:qRT-PCR技術的原理及應用?

    實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)/qRT-PCR,是指在PCR反應體系中加入熒光標記物,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,最后通過擴增曲線對未知模板進行定量分析的方法。一般用于mRNA轉錄水平的定量研究、不同樣本或基因組中DNA拷貝數的測定、基因芯片結果驗證、藥效分析等。

    Q:qRT-PCR檢測對樣品有何要求?

    取材后新鮮組織須于-80℃保存,干冰運輸。動物組織>100mg,細胞數>106,植物組織>0.5g、幼嫩組織為宜,預計可以檢測4個指標,避免反復凍融。當檢測基因數較多時樣品量須隨之增加。

    Q:Real-time同電泳檢測產物的PCR有何優勢?

    Real-time qPCR通過熒光信號在每個反應循環終點檢測,反應指數增長期,可以真實監測模板起始量,線性范圍可達5——7個數量級;而終點法重復性不佳、線性范圍較窄,且產物電泳檢測受限于片段大小和凝膠分辨率、膠染料靈敏度等因素,線性范圍在100-fold左右。

    Q:染料法與探針有何區別及優劣勢?

    染料法以SYBR Green熒光強度的大小為指標來檢測DNA的擴增,不需探針法中設計合成熒光標記探針,因此染料法實驗周期及成本都得以降低。染料法可能會檢測出引物二聚體等非特異擴增產物,需要通過進行融解曲線分析來確認反應產物是否特異性擴增,同時在引物設計及反應條件方面都需注意優化。探針法相對較易保證反應特性,但在檢測靈敏度方面同染料法并無高低之分。金開瑞默認使用染料法。

    Q:相對定量和絕對定量分別指什么?

    相對定量用于測定實驗組樣本中目的序列拷貝數相對于對照組樣本中目的序列拷貝數的變化倍數,比較各組樣本間的Ct值;

    絕對定量測定待測樣本中目的序列拷貝數的數量,需要通過標準品繪制標準曲線。

    Q:microRNA檢測的引物設計中,頸環法同polyA加尾法有何區別?

    行使功能的microRNA成熟形式一般僅18——25nt,因此在逆轉錄環節通過特定引物增加其長度,以便于qPCR過程正常進行。頸環法中的逆轉錄引物由自身可形成頸環結構的通用序列加上目的microRNA 3’端堿基的反向互補序列;polyA加尾法即在逆轉錄前先加polyA尾,然后通過oligo(dT)引物進行逆轉錄。方法設計及實驗成本均高于加尾法,但在檢測靈敏度及特異性方面具有優勢。

    Q:熒光定量PCR實驗中無Ct值出現

    (1)反應的循環數不夠:一般要在35個循環以上,但是過多的循環次數可增加背景值。

    (2)檢測熒光信號的步驟有誤:SYB-Rgreen法(SG法)采用的是72延伸時采集熒光信號,Taman法則是在退火結束或延伸結束時進行信號采集。

    (3)引物或探針降解: 可通過PAGE電泳檢測其完整性,若是電泳條帶呈彌散狀,可考慮重新合成引物或探針。

    (4)模板量不足: 對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

    (5)模板降解: 避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。

    (6)序列或者引物有誤:檢測樣品中不含有待檢測基因。

    Q:Ct值出現過晚(Ct>38)

    (1)擴增效率低: 優化反應條件;設計更好的引物或探針;改用三步法進行反應等。

    (2)模版降解或模版濃度太高。

    (3)試劑靈敏度不好:更換更高靈敏度、抗干擾的試劑。

    (4)檢測基因結構復雜:高GC、復雜二級結構和長片段模版,都會影響PCR擴增。

    (5)擴增產物太長: 一般采用80-150bp的產物長度。

    Q:擴增效率低

    (1)引物或探針不佳: 重新設計更好的引物和探針。

    (2)反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

    (3)反應條件不夠優化:可調整退火溫度或改為三步擴增法。

    (4)反應體系中有PCR反應抑制物:一般是加入模板時所引入,應先把模板適度稀釋,再加入反應體系中,減少抑制物的影響。

    Q:溶解曲線不止一個主峰

    (1)引物設計不夠優化:應避免引物二聚體和非特異性擴增出現。

    (2)同源性比較高:被檢測基因在待檢測樣品有同源性較高的序列。

    (3)模板有基因組的污染:RNA提取過程中避免基因組DNA的引入,或通過引物設計避免非特異擴增。

    Q:標準曲線線性關系不佳

    (1)加樣/稀釋誤差: 使得標準品不呈梯度。

    (2)標準品出現降解: 應避免標準品反復凍融,或重新制備并稀釋標準品。

    (3)引物或探針不佳: 重新設計更好的引物和探針。

    (4)模板中存在抑制物,或模板濃度過高

    Q:負對照有信號

    (1)引物設計不夠優化:應避免引物二聚體和發夾結構的出現。

    (2)模板有基因組的污染:RNA提取過程中避免基因組DNA的引入,或通過引物設計避免非特異擴增。

    (3)實驗器材污染:移液器、水、槍頭或者熒光定量PCR孔內有熒光污染。

    Q:如何提高實驗反應的靈敏度與特異性?

    (1)確定模板RNA完整性,無DNA污染。

    (2)RNA模板中不應含有擴增反應的抑制劑。

    (3)為了防止模板降解,在反應體系中加入RNase抑制劑RNasin。

    (4)使用適量的模板RNA,模板量太多會降低特異性,太少會導致擴增不出條帶或條帶太弱。

    (5)若模板中有二級結構,可通過提高逆轉錄反應溫度來提高擴增效果。

    (6)設計引物時,避免在引物3’端含有互補序列,避免形成內部發卡結構。

    Q:避免RNA降解的方法有哪些?

    (1)在用來驗證完整性之前先在變性膠上分析RNA。

    (2)運用良好無污染的技術分離RNA

    (3)將組織提取后立刻提取RNA,并將提取好的RNA反轉錄為cDNA進行低溫保存。

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