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常見問題

熒光定量PCR引物的設計原則與方法primer3plus

作者:解螺旋???發布時間:2020-05-18

    實時熒光定量PCR是一種在DNA擴增反應中,以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。

    實時熒光定量PCR是實驗室最常用的實驗。研究基因在mRNA表達水平,以及驗證基因敲除后下游靶基因變化情況等等。對于新手來說,如何利用primer3plus快速設計引物呢?

    首先,推薦三個在線設計實時熒光定量PCR引物的網站,不用安裝軟件,直接上網就可搞定。

    一、Primerbank

    1.  首先進入網站主頁,https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/。選擇Keyword,根據自己需求選擇種屬以及基因名稱。比如設計人類BCL2基因。
    Primerbank

    2.點擊submit后可以看到以下界面,網站會推薦多對引物,可以根據引物長度、Tm值選擇。
    點擊submit

    二、Pubmed

    1. 在Pubmed網站找到BCL2基因組序列,點擊FASTA獲得基因序列后,將基因序列下載到桌面上。
    點擊FASTA

    2.點開pubmed主頁上面的Blast,進入Primer-BLAST, 輸入基因序列,可以根據自己實驗要求選擇引物長度。
    選擇引物長度
    選擇引物長度

    3.點擊Get primer之后,可以得到多對引物序列??梢愿鶕镩L度等要求進行篩選。

    三、Primerplus3

    1.在Pubmed-gene獲得基因序列后,在primer3plus主頁上輸入基因序列,網址; http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi。
    輸入基因序列

    2.點擊general setting,設置引物擴增長度,一般可設置擴增長度偏大一些,然后根據推薦引物選取合適擴增長度。
    設置引物擴增長度

    3. 點擊pick primers后,首先會看到優選推薦的一對引物,同時在序列中看到引物所在位置。Primer3plus網站中可以看到引物Tm值以及GC含量。
    引物所在位置

    最后簡單介紹一下實時熒光定量PCR引物設計原則:

    (1)引物長度一般在15——30堿基之間,過長會導致其延伸溫度大于74℃,不適于TaqDNA聚合酶進行反應。

    (2)引物GC含量在40%——60%之間,Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度,一般計算公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計引物的Tm值。

    (3)引物應具有特異性。引物設計完成以后,應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性,就可以進行下一步的實驗了。

    (4)引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列,否則引物自身會折疊成發夾結構使引物本身復性。

    (5)引物擴增長度:一般RT-PCR引物擴增長度在100-200bp。

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